响应面法优化龙须菜蛋白酶解工艺及酶解液的抗氧化活性

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(鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025)



响应面法优化龙须菜蛋白酶解工艺及酶解液的抗氧化活性

于慧,刘海梅,李蒙娜,林诗琪,魏飞龙,郭鸿阳

(鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025)

为获得高抗氧化活性的龙须菜蛋白酶酶解液,运用响应面(RSM)分析方法对龙须菜蛋白酶解工艺条件进行优化。经单酶筛选,在单因素实验基础上,以亚铁离子螯合率和DPPH自由基清除率为主要指标,水解度为辅助指标,研究酶解时间、pH、酶解温度、底物质量浓度、加酶量对龙须菜蛋白酶解液抗氧化活性和水解度的影响。结果表明:在所选的5种蛋白酶中,复合蛋白酶是龙须菜蛋白酶解的最适用酶;酶解液抗氧化活性的最优酶解条件为酶解时间8.1 h、酶解温度50.1 ℃、pH7.0、底物浓度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g)。在此条件下,酶解液的亚铁离子螯合率为74.61%,DPPH自由基清除率为47.66%,水解度为17.58%。对比常用抗氧化剂,酶解液在亚铁离子螯合能力方面显著高于0.01%维生素C和0.01% BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和还原能力方面,酶解液低于0.01%维生素C和0.01% BHA(p<0.05)。优化后的龙须菜蛋白酶酶解液具有一定的抗氧化活性。

龙须菜,酶解,响应面,抗氧化活性,水解度

龙须菜(Gracilarialemaneiformis)又名江蓠、凤菜、海菜等,属于红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属,是一种红藻类海洋植物[1-2],含有多种营养物质,除多糖和粗纤维外,其蛋白质含量约占藻体的19%,仅次于紫菜[3]。在我国龙须菜养殖规模大、产量高且生产成本低,是我国重要的经济藻类,主要集中在山东、福建、浙江、广东、海南省等沿海地区[3]。它既是食品工业中提炼琼脂的主要原料,又可以作为优质饲料来养殖鲍鱼,还可以成为人类的绿色保健食品[3],在食用、药用、科学研究、生物、水产养殖方面都有其独特的应用价值。目前,关于龙须菜活性物质的研究主要集中于其多糖[4]。

表1 不同蛋白酶水解实验条件Table 1 Experimental conditions for different proteases

抗氧化多肽通常由3～20个氨基酸残基组成,具有螯合金属离子、抑制和延缓脂质氧化,以及保护人体组织器官免受自由基侵害等作用。食源性蛋白质通过水解作用得到的抗氧化多肽具有抗氧化性强、安全性高和易被吸收等特点,因此在食品行业中引起了广泛的关注[5-6]。尤其近几年,由于海藻的氨基酸组成均衡,有关其生物活性多肽的研究也极为活跃,研究人员已从海藻中分离得到多种可清除体内自由基,具有抗氧化作用的海藻活性肽[7-9],但其主要集中在螺旋藻、紫菜等蛋白质含量较高的藻类中,而其他藻类的蛋白酶解研究极其少见。据报道[10],藻类在工业生产过程中,有大量的以蛋白质为主体的废弃物产生,为了提高资源的有效利用率,本团队在裙带菜的蛋白酶解研究中发现了其蛋白酶酶解液具有较好的亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力[11]。而龙须菜的蛋白质含量虽然低于紫菜,但比裙带菜高,有关龙须菜蛋白酶解多肽的研究也极少见,因此,本实验利用复合蛋白酶水解龙须菜蛋白,在单因素实验基础上,运用响应面分析法对水解工艺条件进行优化并研究酶解液的抗氧化活性,旨在为酶解制备生物活性肽和龙须菜的深加工提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

龙须菜(Gracilarialemaneiformis) 采于山东日照，使用前清洗、冻干、粉碎并过80目筛后置于-18 ℃保存用(蛋白质含量为17.39%);复合蛋白酶(Protamex)(1.5 AU/g) 丹麦诺维信有限公司;Alcalase(2.4 AU/g) 南京诚纳化工有限公司;胃蛋白酶(3000 U/g) 上海蓝季科技发展有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶(25 U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海化成工业发展有限公司；菲洛嗪 美国Sigma公司;维生素C、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、无水乙醇等 均为分析纯。

pB-10型pH计 新锐仪表仪器有限公司;ZHWY-1102双层恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;LGJ-18S真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;XMTD-2MA电热恒温水浴锅 山东省龙口市先科仪器公司;TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂;XW-80A微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;721型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 龙须菜粗蛋白酶解工艺流程 龙须菜粉末→加磷酸缓冲溶液→保温酶解→灭酶(85 ℃,15 min)→离心(5000 r/min，20 min)→取上清液得到酶解液

1.2.2 最佳酶种类的选择 参照文献[12]所述方法,称取1 g龙须菜粉末于250 mL锥形瓶中,加入100 mL磷酸缓冲溶液搅拌均匀,分别向其加入100 mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase 2.4L、复合蛋白酶及木瓜蛋白酶,按表1所示,在其各自最适条件下酶解8 h。85 ℃灭酶15 min,离心(5000 r/min,10 min),取上清液测定其亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 最佳酶解时间的确定 以优选的复合蛋白酶为水解酶,在底物质量浓度10 g/L,加酶量0.1%,酶解温度50 ℃,pH7.0的条件下,选取酶解时间分别为2、4、6、8、10 h,研究酶解时间对亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影响。

1.2.3.2 最适pH的确定 以优选的复合蛋白酶为水解酶,在酶解时间为8 h,底物质量浓度10 g/L,加酶量为0.1%,酶解温度50 ℃的条件下,选取pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,研究pH对亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影响。

1.2.3.3 最适酶解温度的确定 以优选的复合蛋白酶为水解酶,在酶解时间为8 h,pH7.0,底物质量浓度10 g/L,加酶量0.1%的条件下,选取酶解温度分别为35、40、45、50、55 ℃,研究酶解温度对亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影响。

1.2.3.4 最适底物浓度的确定 以优选的复合蛋白酶为水解酶,在酶解时间为8 h,酶解温度50 ℃,pH7.0,加酶量为0.1%的条件下,不同底物质量浓度分别为1、2、5、10、15 g/L,研究底物质量浓度对亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影响。

1.2.3.5 最适加酶量的确定 以优选的复合蛋白酶为水解酶,在酶解时间为8 h,底物质量浓度为10 g/L,酶解温度50 ℃,pH7.0的条件下,选取酶的添加量分别为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,研究加酶量对亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影响。

1.2.4 响应面分析实验 在单因素实验基础上,运用Box-Behnken的中心组合实验设计原理,以酶解时间(A)、pH(B)、酶解温度(C)为自变量,DPPH自由基清除率和亚铁离子螯合率为响应值,进行三因素三水平的响应面实验,因素水平设计见表2。

表3 不同蛋白酶对龙须菜蛋白酶解效果的影响Table 3 Effect of protease type on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

注:同列字母不同表示差异显著(p<0.05);表6同。

表2 Box-Behnken实验设计Table 2 Box-Behnken experimental design

1.2.5 水解度的测定 采用甲醛滴定法[13]。

1.2.6 酶解液DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[14]所述方法,将2 mL龙须菜蛋白酶酶解液加入到含2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的试管中,迅速混匀,并在室温下暗处反应30 min,测定517 nm波长处的吸光度。同时以2 mL磷酸缓冲溶液取代龙须菜蛋白酶酶解液的试管为对照实验;2 mL乙醇取代DPPH乙醇溶液的试管作空白实验。按下式进行DPPH自由基清除率的计算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1为样品实验的吸光度;A2为空白实验的吸光度;A3为对照实验的吸光度。

1.2.7 酶解液对亚铁离子螯合能力的测定 参照文献[15]所述方法,向含有2.7 mL蒸馏水和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液的试管中,加入2 mL龙须菜蛋白酶解液,然后加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液并振荡混匀,室温反应10 min,测定其波长562 nm处吸光度。用蒸馏水替代菲洛嗪溶液作为空白实验。按下式进行亚铁离子螯合率的计算。

亚铁离子螯合率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1为实验组的吸光度:A2为空白组的吸光度;A3为对照组的吸光度。

1.2.8 还原力的测定 参照文献[16]所述方法,向试管中依次加入1 mL一定浓度的蛋白酶酶解液,2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH6.6),2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,混匀,50 ℃水浴30 min后,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液。取上清液2.5 mL于比色管中,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室温放置10 min后,于波长700 nm处测定其吸光度,记为酶解液的还原力。还原能力的强弱与吸光值成正比。

1.3数据处理

响应面实验设计和数据分析采用Design-Expert 8.0.6软件。采用Tukey-Kramer post-hoc test对实验结果进行差异显著性分析,用Excel 2010软件对数据进行平均数和标准偏差的统计分析,结果以平均值±标准偏差表示。

2结果与分析

2.1最佳酶种类的选择

不同蛋白酶对蛋白质水解具有不同的特异酶切位点,可水解肽链上不同的部位[17]。由表3可知,复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、胃蛋白酶5种蛋白酶酶解龙须菜的产物均有一定的亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力,然而,这些蛋白酶酶解液间的抗氧化活性存在显著差异,这些结果表明了龙须菜蛋白酶解后形成的不同多肽拥有差异显著的亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力。其中,复合蛋白酶的酶解产物具有最高的亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力,且水解效果最好。同时,复合蛋白酶是针对水解食物蛋白质开发的杆菌蛋白酶复合物,与其他内切蛋白酶相比,具有明显优势是其所得的蛋白酶水解液没有苦味,提高了酶解产物质量[18]。所以选择复合蛋白酶作为酶解龙须菜蛋白的实验用酶。

另外,对比木瓜蛋白酶和Alcalase 2.4L蛋白酶的酶解产物,虽然龙须菜在Alcalase 2.4L蛋白酶处理下,其水解度显著高于木瓜蛋白酶处理的龙须菜,然而在亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力方面,其酶解液低于木瓜蛋白酶处理后的龙须菜酶解液。这些结果表明,酶解液的抗氧化能力与其水解程度没有显著相关性。在后续龙须菜蛋白酶解条件优化研究中,亚铁离子螯合率和DPPH自由基清除率为主要指标,水解度为辅助指标。

2.2单因素实验

2.2.1 酶解时间的选择 由图1可知,随着蛋白酶酶解时间的延长,在2～8 h范围内,亚铁离子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度不断增加,并在8 h时,亚铁离子螯合率为83.88%,DPPH自由基清除率为33.63%,水解度为10.49%,均达到最高值。说明抗氧化能力的提高,与龙须菜酶解后抗氧化多肽的产生有关。此后,随着酶解时间的延长,酶解液的亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率开始下降,这可能因为具有抗氧化活性的肽段被进一步水解为更小的肽段和氨基酸等而减弱或失去活性。因此,酶解时间以8 h为宜。

图1 酶解时间对龙须菜蛋白酶解效果的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.2 pH的选择 酶解环境的pH常会影响到酶的稳定性,同时,pH也会影响到底物的解离程度,进而影响酶与底物间的结合而作用于酶解反应[19]。pH对龙须菜蛋白水解度及抗氧化活性的影响如图2所示。随着pH的增加,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度开始逐渐增大,当pH为7.0时,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均达到最大值,分别为72.41%、57.39%和17.01%。此后,随着pH进一步增加,酶解液的亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均开始下降。因此,酶解pH以7.0为宜。

图2 pH对龙须菜蛋白酶解效果的影响Fig.2 Effect of pH on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.3 酶解温度的选择 图3显示了温度对龙须菜酶解反应的影响。在35～50 ℃范围内,随着酶解温度的升高,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度呈现逐渐升高的趋势,当酶解温度为50 ℃时,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均达到最大值,分别为71.12%、45.42%和17.01%。这是由于在酶解过程中,提高温度可以显著提高酶解速度,促进龙须菜蛋白水解,从而产生更多的抗氧化多肽。当酶解温度进一步提高时,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈显著下降趋势。这是由于温度过高,蛋白酶变性,从而降低了酶解效率。因此,酶解温度以50 ℃为宜。

图3 酶解温度对龙须菜蛋白酶解效果的影响Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.4 底物质量浓度的选择 由图4可知,随着龙须菜质量浓度的增加,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈现先逐渐增大后减小的趋势,在龙须菜质量浓度为10 g/L时,达到最大值,分别为74.09%、38.41%和15.92%。这是因为随着龙须菜浓度的增加,接触几率增加而提高水解度,同时,水解后产生的多肽含量增加,使亚铁离子螯合能力和DPPH自由基清除能力得以提高;而龙须菜质量浓度进一步增加时,酶浓度逐渐不足,其催化功能没有完全发挥,故水解不彻底,进而对酶解液的抗氧化活性产生影响[20]。因此,底物质量浓度以10 g/L为宜。

图4 底物质量浓度对龙须菜蛋白酶解效果的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.5 加酶量的选择 加酶量会引起酶反应体系中酶浓度的变化,进而影响龙须菜蛋白的酶解效果,从而影响酶解液的抗氧化活性[21]。由图5可知,随着加酶量的增加,亚铁离子螯合率、DPPH自由基清除率以及水解度呈现先升高后降低的趋势,在加酶量0.1%时取得最大值,分别为71.43%、39.20%和11.95%。所以加酶量以0.1%为宜。

图5 加酶量对龙须菜蛋白酶解效果的影响Fig.5 Effect of enzyme dose on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.3响应面实验

表5 二次回归方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

根据单因素实验结果,选取酶解温度、酶解时间、pH为变量,进行三因素三水平的响应面实验。复合蛋白酶酶解龙须菜蛋白的工艺条件优化根据Box-Behnken 实验设计进行了17组实验,5组为中心点重复实验(表4)。本实验把抗氧化活性作为酶解工艺优化的第一指标,水解度作为辅助指标,对DPPH自由基清除能力Y1、亚铁离子螯合能力Y2与各水解因素进行多元回归拟合,得二次多项式拟合方程为:Y1=46.73+2.16X1-4.08X2+5.13X3-7.42X1X2-0.30X1X3-4.09X2X3-5.13X12-16.07X22-6.22X32;

Y2=71.56-0.84X1+9.97X2-4.74X3+2.71X1X2-2.97X1X3+1.65X2X3-7.68X12-13.03X22-5.39X32。

表4 Box-Behnken实验设计及结果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

Y1方程回归模型的决定系数R2=0.9021,p<0.01,说明模型达到极显著水平,失拟项p=0.0517,影响不显著,说明该方程拟合良好;Y2方程回归模型的决定系数R2=0.9141,p<0.01,说明模型达到极显著水平,失拟项p=0.0530,影响不显著,说明该方程拟合良好[22]。因此,可以应用Y1和Y2两个方程描述各响应变量与两个相应值之间的关系,以评价各因素对相应值影响的显著性。

由表5可以看出,响应值为DPPH自由基清除率的模型,pH二次项(X22)对响应值影响极显著,酶解温度(X3)、酶解时间与pH交互项(X1X2)对响应值影响显著,各响应因素影响程度依次为:X3>X2>X1,酶解温度对于酶解液DPPH自由基清除率的影响最大;响应值为亚铁离子螯合率的模型,pH(X2)、pH二次项(X22)对响应值影响极显著,酶解温度(X3)、酶解时间二次项(X12)对响应值影响显著,各响应因素影响程度依次为:X2>X3>X1,pH对于酶解液亚铁离子螯合率的影响最大。

通过图6和图7即可对任何两因素交互影响抗氧化活性效应进行分析与评价。响应面为平滑的曲面,且开口向下,说明在响应曲面上存在最大响应值,可从中确定最佳因素水平范围。结果表明,酶解时间和pH交互作用对DPPH自由基清除效果影响显著,其他各因素的交互作用不显著。

2.4最佳制备工艺条件的确定及验证

图6 各因素交互作用对DPPH自由基清除能力的影响Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of different variables on DPPH radical scavenging activity

图7 各因素交互作用对亚铁离子螯合能力的影响Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of different variables on ferrous ion-chelating ability

根据Box-Behnken 实验所得的结果和二次多项式回归方程,对所建立的数学模型进行工艺参数最优化搜索,获得了各因素的最佳酶解条件组合为:酶解温度50.07 ℃、酶解时间8.07 h、pH7.04,此时DPPH自由基清除率为46.36%,亚铁离子螯合率为72.24%,水解度为17.68%。为了检验模型预测的准确性,选取酶解温度50.1 ℃、酶解时间8.1 h、pH7.0、底物质量浓度10 g/L、加酶量为0.1%做3组平行实验进行响应面实验验证,得到的DPPH自由基清除率达47.66%,亚铁离子螯合率达74.61%,水解度达17.58%,此结果与最佳理论条件下所得的结果接近。

2.5酶解物与其他抗氧化剂的比较

表6显示,与酶解前的龙须菜相比,最优条件下龙须菜蛋白酶酶解液拥有更强的DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原力(p<0.05),这说明龙须菜蛋白酶酶解后产生的多肽,提高了整体酶解液的抗氧化活性。这可能是由于龙须菜蛋白结构紧密和水溶性等问题而表现出较弱的抗氧化能力,而蛋白酶水解打破了龙须菜蛋白的天然结构,形成了更多开放、暴露的氨基酸残基,从而提高了其抗氧化活性。

表6 龙须菜蛋白酶解液与常用抗氧化剂之间的比较Table 6 Comparison of antioxidant activities between protamex-hydrolyte and common antioxidants

抗氧化剂可以通过螯合过渡金属离子来抑制氧化反应的发生。其中,铁离子对细胞中ROS的形成起关键作用[23],因此本研究选取了亚铁离子螯合率来评价酶解液的抗氧化活性。结果表明,对比常用天然抗氧化剂0.01%维生素C和合成抗氧化剂0.01%BHA[14],酶解前的龙须菜拥有更好的亚铁离子螯合能力(p<0.05),此结果与其他藻类类似,这主要与其包含的海藻酸盐等多糖及酚类物质的存在有关[15]。而最优条件下龙须菜蛋白酶酶解液亚铁离子螯合能力更强(p<0.05),达到了74.61%,这可能由于蛋白酶解使肽键断裂,自由氨基和羧基浓度的增加隔离了体系内促氧化的金属离子,从而提高了其抗氧化效果。其次可能是由于某些氨基酸残基的暴露增加引起的,如组氨酸,它是常见具有金属螯合能力的氨基酸[14]。通过对龙须菜蛋白质立体结构的酶解,使具有金属螯合能力的氨基酸残基更多地暴露于水溶液中,增强了与溶液中亚铁离子的螯合能力。然而,龙须菜蛋白酶酶解液的亚铁离子螯合能力随着蛋白水解度上升,达到峰值后,反而随蛋白水解度的进一步上升而降低(图5),这暗示了龙须菜蛋白酶酶解多肽中有适合螯合亚铁离子的空间结构存在,随着进一步水解遭到破坏,从而减弱了亚铁离子螯合能力。近年来铁元素强化食品的社会需求越来越多,具有亚铁离子螯合能力的安全有效的抗氧化剂非常受关注,尤其是具有亚铁离子螯合能力的多肽,因其亚铁离子螯合物不仅具有营养性强、生物效价高和吸收快等优点,而且具备抗氧化、抗菌等生物活性,同时,相对于氨基酸亚铁离子螯合物有更好的稳定性和配合率。因此,这种可食用性天然多肽值得进一步的深入研究和开发利用[24]。

而在DPPH自由基清除能力和还原能力方面,最优条件下龙须菜蛋白酶解液显著强于酶解前的龙须菜(p<0.05),但比0.01%维生素C和0.01%BHA的抗氧化能力弱(p<0.05)。龙须菜蛋白酶酶解液的还原能力提高,主要与蛋白酶酶解暴露出还原性氨基酸残基有关。而龙须菜蛋白酶酶解液DPPH自由基清除能力的进一步提高,可能与龙须菜蛋白酶酶解产生的小分子多肽有关。现有研究显示,小分子多肽可在溶液与溶质界面或者固相与气相界面形成薄膜,从而隔离并保护目标物。如Chang等研究发现,通过蛋白酶解处理,猪血红蛋白显著提高了DPPH自由基清除能力[24]。另外,乳清蛋白随着其水解时间的增加,其DPPH自由基清除能力和抗脂质氧化能力均显著增加[14],这表明了小分子多肽比大分子蛋白质有更佳的DPPH自由基清除能力。本研究中蛋白酶酶解处理,使龙须菜自由基清除能力的提高与血红蛋白和乳清蛋白的研究结果非常相似,因此,小分子多肽与蛋白酶酶解提高龙须菜自由基清除能力相关。

3 结论

实验确定了酶解龙须菜蛋白的最佳用酶为复合蛋白酶。通过单因素实验和响应面实验分析,得优化龙须菜蛋白的最佳工艺条件:酶解时间8.1 h、酶解温度50.1 ℃、pH7.0、底物浓度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g龙须菜粉末),在此条件下酶解龙须菜蛋白,亚铁离子螯合率达74.61%,DPPH自由基清除率为47.66%,水解度达17.58%。对比常用抗氧化剂,在亚铁离子螯合能力方面,酶解液显著高于0.01%维生素C和0.01%BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和还原能力方面,酶解液低于0.01%维生素C和0.01%BHA(p<0.05)。此结果可为今后龙须菜蛋白抗氧化活性肽的分离纯化提供有利基础。

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OptimizationforenzymatichydrolysisofGracilarialemaneiformisproteinandantioxidantactivityofitshydrolysate

YUHui,LIUHai-mei,LIMeng-na,LINShi-qi,WEIFei-long,GUOHong-yang

(College of Food Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China)

Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the process conditions for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. After the single enzyme screening experiments,the ferrous ion-chelating and DPPH free radical scavenging abilities as the main index,the degree of hydrolysis as the auxiliary index,the effects of hydrolysis time,pH,hydrolysis temperature,concentration of substrate and enzyme dose on the degree of hydrolysis and the antioxidant activity of hydrolysates were investigated based on the single factor experiments. The results showed that protamex was the best enzyme for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. The optimal conditions for the ferrous ion-chelating ability and the scavenging activity on DPPH free radical were as follows:hydrolysis time of 8.1 h,pH7.0,temperature of 50.1 ℃,substrate concentrate of 10 g/L,and enzyme dose of 0.1%. Under these conditions,the ferrous ion-chelating ability of hydrolysate was up to 74.61%,significantly higher than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). The scavenging ability of DPPH free radical was 47.66%,and the degree of hydrolysis was 17.58%,lower than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). These results suggested that the protein hydrolysates possess excellent antioxidant activity.

Gracilarialemaneiformis;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antioxidant activity;hydrolysis degree

2016-12-12

于慧(1982-)，女，博士，讲师，研究方向：水产品加工与贮藏，E-mail：zoehuihui@hotmail.com。

教育部留学回国人员科研启动基金项目(第49批)；鲁东大学引进人才项目(LY2013022)。

TS254.9

:A

:1002-0306(2017)12-0157-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.029