气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响

苏兰利，赵银丽，王金荣，黄 进，周 洋，孙贵宾

(河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001)

气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响

苏兰利，赵银丽，王金荣，黄 进，周 洋，孙贵宾

(河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001)

为研究呼吸道大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响，选取24只初始体质量相近、健康状况良好的固始肉仔鸡，随机分为2组，对照组肉仔鸡气管滴注1 mL无菌培养液，大肠杆菌组肉仔鸡气管滴注1 mL大肠杆菌培养液(1×109cfu/mL)。滴注后2 h采集血液和肝脏组织，测定血清中细菌脂多糖(LPS)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量，以及肝脏组织中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果表明，气管滴注大肠杆菌后2 h，大肠杆菌组肉仔鸡血清中LPS含量为33.86 U/mg，较对照组升高了26.15%;AST和ALT含量较对照组分别增加了50.89%(P<0.05)和298.77%(P<0.01);大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织中SOD活性和GSH-PX活性分别为186.60 U/mg和13.20 U/mg，较对照组分别降低了43.83%(P<0.01)和31.18%(P>0.05)；MDA含量增加了51.72%(P<0.05)。综上，气管滴注大肠杆菌后2 h，大肠杆菌大量繁殖，释放出的LPS通过血液循环进入肝脏，肝脏中抗氧化酶活性降低，引起脂质过氧化物堆积，破坏肝脏细胞，导致血清中转氨酶水平升高。

肉仔鸡；大肠杆菌； 抗氧化能力； 肝脏； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽过氧化物酶

大肠杆菌是畜禽体内的常驻细菌，动物机体在病原菌感染、营养不良等应激条件下，体内的大肠杆菌大量繁殖，引发混合性和继发性大肠杆菌病。研究发现，腹腔注射大肠杆菌引起雏鸡肝脏过氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力下降，MDA含量升高[1]；气管滴注大肠杆菌引起仔鸡肺部抗氧化酶活力下降，MDA含量升高[2]。大肠杆菌细胞壁上的细菌脂多糖(LPS)是激发宿主免疫应答，调节免疫反应的主要物质[3-4]；翅静脉注射LPS导致肉仔鸡肝脏SOD含量降低，MDA含量增加，同时血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量升高，肝脏细胞受损[5]。

呼吸道疾病是鸡的常发病，许多呼吸道疾病如禽流感[6]、新城疫[7]和传染性支气管炎[8]等发生时常伴随有大肠杆菌混合性或继发性感染，导致呼吸道疾病呈综合性症状，增加治疗难度，给养鸡行业带来严重的经济损失。呼吸道大肠杆菌病常常引发全身性器官如肝脏、脾脏等发生病理变化[8-9]。但呼吸道大肠杆菌病能否使雏鸡肝脏抗氧化性能降低，以及能否引起肝细胞损伤方面的研究尚未见报道。为此，本研究模拟肉仔鸡呼吸道大肠杆菌感染，测定血清中LPS、ALT、AST含量，以及肝脏组织中抗氧化酶活性和MDA含量，探讨大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化性能及肝脏细胞损伤的影响，旨在为预防和治疗继发性或混合性大肠杆菌感染导致肝脏损伤的疾病提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

ALT、AST检测试剂盒购自济南汉方医疗器械有限公司；GSH-PX活性、SOD活性和MDA含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；LPS含量 ELISA检测试剂盒购自JET BIOFIL公司。

HF生化分析仪购自汉方医疗器械有限公司；酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 供试动物的分组和处理

1.2.1 攻毒用大肠杆菌培养 大肠杆菌菌株为鸡大肠杆菌(01 C84010)，由河南农业大学禽病研究中心提供。将冷藏的大肠杆菌接种于麦康凯琼脂无菌培养液中，37 ℃、200 r/min 条件下培养至对数期(12～18 h)，用无菌培养液稀释，计数，将菌液浓度调整为1×109cfu/mL。

1.2.2 动物处理 选用24只7日龄固始肉仔鸡(河南农业大学畜牧站提供)，随机分为2组，对照组肉仔鸡气管滴注1 mL 无菌培养液，大肠杆菌组肉仔鸡气管滴注1 mL大肠杆菌培养液(1×109cfu/mL)。滴注后2 h观察肉仔鸡临床症状，每组选取12只肉仔鸡，采集血液，分离血清，用于LPS、ALT、AST含量测定；同时采集肝脏，制备组织匀浆，用于MDA含量和抗氧化酶活性测定。

1.3 测定指标及方法

血清中LPS含量测定采用酶联免疫检测法，血清中ALT、AST含量测定采用生化分析法，肝脏组织中SOD活性测定采用羟胺法，GSH-PX活性测定采用比色法，MDA含量测定采用TBA法，均按照试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析和差异显著性分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 气管滴注大肠杆菌后肉仔鸡临床症状及对血清中LPS含量的影响

气管滴注大肠杆菌后2 h，肉仔鸡精神状态萎靡，出现扎堆现象，排水样粪便。解剖鸡只发现，大肠杆菌组肉仔鸡肺部有出血点，肠道水肿和出血，肝脏未见肿大和出血，表明大肠杆菌攻毒成功。

LPS是大肠杆菌引起机体炎症的主要物质。气管滴注大肠杆菌后2 h，大肠杆菌组肉仔鸡血清中LPS含量为33.86 U/mg，较对照组升高了26.15%。说明气管中的大肠杆菌大量繁殖，释放出LPS到血液中，引起肠道出血和水肿，但未引起肝脏临床病理变化。

2.2 气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡血清AST和ALT含量的影响

AST和ALT是肝脏细胞内2种主要的氨基酸代谢酶。从表1可以看出，大肠杆菌组肉仔鸡血清中AST含量达到342.60 U/L，较对照组升高了50.89%(P<0.05)；大肠杆菌组肉仔鸡血清中ALT含量为35.57 U/L，较对照组升高了298.77%(P<0.01)。说明气管滴注大肠杆菌后，释放出的LPS通过血液循环到肝脏，破坏肝脏细胞正常功能，从而导致AST和ALT释放到血液中。

表1 肉仔鸡血清中AST 和ALT 的含量 U/L

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同。

2.3 气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化指标的影响

SOD和GSH-PX能够消除体内产生的自由基，减少MDA的堆积，保护肝脏细胞。从表2可以看出，大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织GSH-PX活性为13.20 U/mg，较对照组降低了31.18%(P>0.05)；大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织SOD活性为186.60 U/mg，较对照组降低了43.83%(P<0.01)；大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织MDA含量达到14.96 nmol/mg，较对照组升高51.72%(P<0.05)。说明气管滴注大肠杆菌降低了肝脏组织中抗氧化物酶的活性，脂质过氧化物的积累量增加。

表2 肉仔鸡肝脏组织匀浆中SOD、GSH-PX活性及MDA含量

3 结论与讨论

3.1 气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡的影响

鸡在患呼吸道疾病时易引发继发性或混合性大肠杆菌病，引起呼吸道疾病加重，并引起肝脏、脾脏等发生病理变化[6-8]，增加治疗难度。本研究通过气管滴注大肠杆菌模拟肉仔鸡呼吸道感染大肠杆菌。结果发现，气管滴注大肠杆菌后2 h，肉仔鸡精神状态萎靡，出现扎堆现象，排水样粪便。解剖发现，大肠杆菌组肉仔鸡肺部有出血点，小肠有出血点和水肿，肝脏未见肿大和出血点。检测发现，气管滴注大肠杆菌后，肉仔鸡血清中LPS含量显著增加。说明气管中的大肠杆菌大量繁殖，引起肺部出血。同时，大肠杆菌释放LPS到血液中，引起肠道水肿和出血，肉仔鸡腹泻和发热，但未引起肝脏病理变化。马广鹏等[1]报道，仔鸡腹腔接种大肠杆菌第5天时，仔鸡发生肝周炎，这与本研究结果不一致，可能是由于供试鸡的年龄、接种大肠杆菌的量以及接种时间不同引起的。

3.2 气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏细胞损伤的影响

ALT和AST是肝脏细胞内重要的氨基酸代谢酶。当肝脏细胞受损时，ALT和AST从细胞内释放到血液中。因此，血清中ALT和AST含量是检测肝脏细胞受损的主要指标。本研究结果显示，肉仔鸡气管滴注大肠杆菌后2 h，血清中ALT、AST含量显著增加，说明肝脏细胞受到损伤。刘秋玲等[10]和付凌等[11]研究表明，腹腔注射LPS引起小鼠血清ALT、AST水平升高；李娇龙等[12]研究表明，腹腔注射LPS引起仔鸡血清ALT、AST水平升高。以上研究结果均与本研究结果一致。本研究中未观察到肝脏的临床病理变化，但血液中ALT、AST含量增加，说明气管滴注大肠杆菌造成了肝脏细胞的损伤。

3.3 气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化性能的影响

肝脏是重要的消化器官和免疫器官，细胞代谢旺盛，易产生活性氧自由基。如果氧自由基不及时清除，与细胞膜磷脂发生反应，将产生过多的MDA等脂质过氧化物，破坏细胞膜结构和功能的完整性。GSH-PX和SOD是机体内重要的抗氧化酶，能及时清除体内的自由基，保护细胞膜免受损伤。本试验结果表明，气管滴注大肠杆菌后2 h，肝脏组织MDA含量显著增加，SOD、GSH-PX的活性显著降低。马广鹏等[1]研究发现，腹腔注射大肠杆菌诱导雏鸡血清和肝脏组织GSH-PX、SOD活性下降，MDA含量上升；李鹤等[5]研究发现，肉仔鸡经翅静脉注射LPS后，其法氏囊中MDA含量升高，SOD、GSH-PX活性降低。此外，体外试验结果也表明，LPS诱导内皮细胞和心肌细胞中MDA含量增加，细胞内SOD、GSH-PX活性显著降低[13-14]。以上研究结果均与本研究结果一致。

综上，气管滴注大肠杆菌后2 h，大肠杆菌迅速繁殖，释放出LPS到血液中，肉仔鸡血清中LPS含量显著增加。LPS通过血液循环进入肠道和肝脏，引起肠道损伤，导致肉仔鸡腹泻。尽管LPS没有引起肉仔鸡肝脏临床病理变化，但降低了肝脏抗氧化物酶的活性，增加脂质过氧化物的堆积量，导致肝脏细胞损伤，ALT和AST释放进入血液。呼吸道大肠杆菌病对于其他日龄肉仔鸡肝脏损伤以及其他器官损伤的影响需进一步研究，以期为呼吸道激发和混合感染大肠杆菌病提供理论依据。

[1] 马广鹏,李术.泻康宁对感染大肠杆菌雏鸡抗氧化功能的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2003(3):30-31.

[2] 苏兰利,王金荣,黄进,等.气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肺部抗氧化性能的影响[J].中国家禽,2016,38(9):14-17.

[3] Caron M J,Emans P J,Don A M,etal.Activation of NF-kB/p65 facilitates early chondrogenic differentiation during endochondral ossification[J].PLoS One,2012,7(3):1-14.

[4] Song Z F,Jin R,Yu S Y,etal.CD40 is essential in the upregulation of TRAF proteins and NF-KappaB-dependent proinflammatory gene expression after arterial injury[J].PLoS One,2011,6(8):1-12.

[5] 李鹤,陈俭清,赵玉莲,等.连翘酯苷对脂多糖诱导的肉鸡肝脏抗氧化作用的影响[J].中国家禽,2013,35(20):20-22.

[6] 艾木热古丽,吐尔逊.产蛋鸡H9亚型禽流感混合感染大肠杆菌病的诊疗[J].中国畜禽种业,2015(6):140.

[7] 于海霞,王成达,王芳,等.一例肉鸡新城疫混感大肠杆菌病的防治体会[J].吉林畜牧兽医,2014(3):44-46.

[8] 张东超,林静,杨宁宁,等.鸡传染性支气管炎继发感染大肠杆菌病的鉴别诊断[J].中国家禽,2016,38(2):56-59.

[9] 张瀚元,张秀英,施路一.中药提取物干预鸡大肠杆菌病发病过程的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2016(3):213-215.

[10] 刘秋玲,龚志华,陈凌,等.L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌引起的免疫应激小鼠肝脏的保护作用研究[J].茶业科学,2016,36(5):484-490.

[11] 付凌,宋剑波,胡春燕,等.牛磺酸对脂多糖诱导的小鼠肝脏损伤的缓解作用[J].动物营养学报,2015,27(3):989-996.

[12] 李娇龙,张俊,邱洪仪,等.三丁酸甘油酯与三乳酸甘油酯对脂多糖刺激肉鸡生长性能、血液生化指标及肝脏能量状态的影响[J].饲料工业,2014,35(18):38-43.

[13] Zhao Q T,Guo Q M,Wang P,etal.Salvianic acid A inhibits lipopolysaccharide-induced apoptosis through regulating glutathione peroxidase activity and malondialdehyde level in vascular endothelial cells[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2012,10(1):53-57.

[14] Wang H Y,Liu X Y,Gan H,etal.LPS induces cardiomyocyte injury through calcium-sensing receptor[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2013,379(1/2):153-159.

Effect of Intratracheal Installation ofEscherichiacolion Antioxidant Activities in the Liver Tissue of Broilers

SU Lanli,ZHAO Yinli,WANG Jinrong,HUANG Jin,ZHOU Yang,SUN Guibin

(College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

To investigate the effects ofEscherichiacoli(E.coli) in respiratory tract on the antioxidant activities in broilers liver,30 broilers with similar body weight were randomly divided into two groups.1×109cfu/mLE.coliwas given to broilers in theE.coligroup by intratracheal instillation,and aliquots of agar were administered to broilers in the control group.Blood and liver tissue sample of broilers were collected after 2 h.The concentration of LPS,alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) in the blood,and the concentration of malondialdehyde(MDA),the activities of glutathione peroxidase(GSH-PX) and superoxide dismutase(SOD) of liver tissue were detected.The results showed that,compared with the control group,the concentration of LPS in blood of broilers in theE.coligroup was increased by 26.15%(33.86 U/mg),AST and ALT in blood in theE.coligroup were increased by 50.89% and 298.77%,respectively.The activities of SOD and GSH-PX in broilers liver in theE.coligroup were decreased by 43.83% and 31.18 %(186.60 U/mg and 13.20 U/mg),respectively.The concentration of MDA was significantly increased by 51.72%.It suggested that intratrachealE.colireleased LPS,the antioxidant ability in liver tissue decreased and liver cells were destroyed in broilers after 2 h.

broiler;Escherichiacoli; antioxidant activities; liver; SOD; GSH-PX

2016-12-24

河南省教育厅自然科学项目(15A230008)；河南省科技厅自然科学项目(142300410012)；河南工业大学高层次人才基金项目(2013BS027)

苏兰利(1971-)，女，河南博爱人，讲师，博士，主要从事新型饲料添加剂研究。E-mail:sulanli@163.com

S855.1

A

1004-3268(2017)06-0147-04