慢性牙周炎基础治疗前后龈沟液中MMP-3和TIMP-2水平的变化①

朱建华,贾会敏,刘继光,李佳薇,苗艺缤

(佳木斯大学附属第二医院， 黑龙江 佳木斯 154002)

慢性牙周炎基础治疗前后龈沟液中MMP-3和TIMP-2水平的变化①

朱建华,贾会敏,刘继光,李佳薇,苗艺缤

(佳木斯大学附属第二医院， 黑龙江 佳木斯 154002)

目的：探讨根据检测慢性牙周炎基础治疗前后GCF中MMP-3的水平以及TIMP-2的水平和MMP-3/TIMP-2的比值。方法：选取15例经临床确诊的慢性牙周炎患者口腔内20颗重度牙周病的患牙的龈沟液(GCF)样本，同时选取15例健康对照组患者口腔内的20个牙位的GCF样本，采用ELISA实验法检测患牙龈沟液中MMP-3和TIMP-2的含量，MMP-3/TIMP-2比值。在开始治疗前采集被选患者的GCF，同时也要对临床相关的指标详细探查，并在系统治疗完成后以1个月时间为标准重复取样。结果：牙周基础治疗结束后MMP-3和TIMP-2的总量与治疗前相比显著下降(P<0.05),治疗前后MMP-3与TIMP-2的总量与对照组相比有显著差别(P<0.05),治疗结束后MMP-3与TIMP-2的比值与治疗前相比显著下降，并高于正常对照组MMP-3与TIMP-2的比值。MMP-3的含量与TIMP-2的含量呈显著正相关(P<0.01)。结论:慢性牙周病患者GCF中MMP-3和TIMP-2的水平以及MMP-3与TIMP-2的比值可用作监测慢性牙周炎病情的敏感指标。

慢性牙周炎；龈下刮治术；根面平整术；龈沟液；MMP-3；TIMP-2；ELISA

口腔病变对人类健康造成的危害已得到充分证实，其中一种疾病是在人类口腔中最常见的牙周病，近年来该疾病由于在全球范围内不断上升的发病率而引起更多学者的深入研究。此前，牙周病变被认为是引起牙周组织缺损以及造成牙齿缺失的确定性病因，因此，对牙周病的致病因素，进展以及临床治疗的探究发挥十分重要的意义。在牙周病不断进展的过程中，特别是一些炎性因子逐渐的对牙周组织进行破坏和分解，而MMPs及其抑制因子(TIMPs)作为能导致牙周病发生的蛋白水解酶起着重要作用。研究表明，在机体正常状况下，MMPs与TIMPs二者间维持着动态均衡的关系，两者间的动态均衡维护了牙周组织的生理结构和正常的功能。而在某些刺激因子的作用下，MMPs与TIMPs的比重超出正常范围引起MMPs的过多分泌，促使细胞外基质降解增多，因此在牙周病中二者之间的平衡关系被打破，表现在牙周方面的破坏成为造成牙周病发生的原因之一[1]。龈沟液检测样本的收集简单快捷方便，患者易于接受，适用人群范围很广。本课题通过测定龈沟液中MMP-3和TIMP-2的水平，研究二者之间的水平以及它们之间的平衡与慢性牙周炎的关系，通过检测MMP-3和TIMP-2的水平来监控病情，分析疗效，二者含量的失衡有可能参与慢性牙周炎的病情发展，并将MMP-3与TIMP-2的比值作为新的因素进行比较分析。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源：选取2016-01～2016-03来本医院牙周黏膜病科就诊并确诊的慢性牙周病患者(根据1999年美国牙周病学会的分类标准)。纳入标准：(1)无任何全身系统性疾病；(2)至少在6个月之内不曾使用抗生素或至少在3个月之内未使用过非淄体类抗炎药；(3)1年之内无任何牙周病治疗史。排除标准：妊娠或者哺乳期的妇女；(2)吸烟的患者；(3)口腔内的余留牙不足20颗；(4)有过正畸治疗史。从完全适合以上标准的患者的口腔内选择1～2颗重度的牙周病患牙(牙周袋深度在6mm以上，附着丧失在5mm以上，牙槽骨在X线片上面显示吸收程度在根长的1/2以上甚至接近根长的2/3)为试验牙，从15位患者口腔中选择20颗试验牙，选中男9例，女6例，年龄20～60岁。

1.1.2 龈沟液样本的采集：本研究采取滤纸条称重法采集龈沟液，将滤纸条放入符合标准的受试牙牙周袋内采集龈沟液，30s后取出，间隔2min在相同受试牙位置重复采集龈沟液，将样本置于1.5mLEppendorf管中，立即称重并记录结果，随后将收集的样本存放于-20℃的冰箱中直到样本收集完毕检测MMP-3和TIMP-2的含量。

1.2 主要仪器和试剂

MMP-3ELISA试剂盒,TIMP-2ELISA试剂盒, 酶标仪,MMP-3酶标板,TIMP-2酶标板, 低温冰箱, 高速离心机。

1.3 方法

依据ELISA试验方法检测龈沟液中的MMP-3和TIMP-2。按照ELISA的试剂说明书进行操作，将全部收集到存放于冰箱内的样本取出放于室温下一次性解冻，加入约250μLPBS缓冲液(pH=7.4)，使用振荡器恒温震荡1h，之后使用400r的高速离心机以10000r/min的速率离心10min，以去除多余的杂质。取上清液分别装入之前准备好的两只干净离心管内，用MMP-3和TIMP-2试剂盒测定MMP-3和TIMP-2的含量。

1.4 统计学方法

2 结果

牙周基础治疗前后与正常对照组间龈沟液的量均有显著差异(P<0.05)。牙周基础治疗完成后MMP-3，TIMP-2的总量与治疗前相比显著降低(P<0.05)，治疗前后MMP-3，TIMP-2的总量与正常对照组MMP-3，TIMP-2的总量对比有显著差异(P<0.05)。

牙周基础治疗结束后MMP-3与TIMP-2的比值与治疗前对比下降(P<0.05)，治疗结束后MMP-3与TIMP-2的比值高于正常对照组MMP-3与TIMP-2的比值(P<0.05)。MMP-3与TIMP-2在GCF中的含量呈显著正相关(P<0.01),见表1～3。

表1 牙周基础治疗前后与正常对照组间龈沟液量的对比

表2 牙周基础治疗前后与正常对照组之间龈沟液量的对比±s,n=20,ng/μL)

表3 牙周基础治疗前后以及正常对照组MMP-3和TIMP-2的含量

3 讨论

牙周病是由于炎症因子的刺激而以破坏牙周组织为主的慢性进行性变病，在牙周组织逐渐受损的过程中，MMPs发挥非常重要的作用[2]。近年来很多研究采取收集患牙的龈沟液来探讨慢性牙周炎与MMPs水平之间的关系，在正常的情况下，有大量的菌斑微生物存在于龈沟内，龈沟内的渗透梯度处于不断的变化中，故龈沟内会存在少量的龈沟液，当牙周组织由于刺激而发生炎症时，龈沟以及结缔组织发生水肿，同时龈沟液的总量会明显增加[3]。而本实验表明：牙周基础治疗前后龈沟液的量与正常对照组龈沟液的量均有显著差异(P<0.05)。而MMP-3是一种基质溶解素，可以激活不同类型的MMPs，使它们由最初的酶原形式逐渐转变为具有活性的MMPs，从而导致牙周骨质的降解和改建，对于加重牙周组织炎症起到很关键的作用[4，5]。MMPs能降解细胞外基质，同时参与人体内结缔组织的降解，重建，一些炎症反应等生理病理过程[6]。然而TIMPs在体内对MMPs起到一定的抑制作用[7]，目前TIMPs家族包括4种：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，它们在体液和组织内分布非常广泛，TIMPs能够结合MMPs的催化部位，对MMPs降解ECM进行抑制，MMPs和TIMPs在体内维持着ECM降解和分泌的平衡[8]。有研究报道，有不同种类的基因对MMPs，TIMPs的表达进行调控，而TIMPs的表达同样受到MMPs的影响，从而构成十分错综复杂的网络系统，在机体组织发生炎症时，MMPs的表达与TIMPs的表达相比呈增高的趋势，因此，这种情况导致破坏，降解机体的炎症组织。同时，在牙周组织发生重度的炎症时，组织中会存在许多炎性细胞，包括单核细胞，巨噬细胞等能够生成TIMPs，而当牙周组织的炎症得到有效的控制后，随之组织中的炎性细胞会相对减少，产生TIMPs的量同时也会对应减少[9，10]。在人体正常组织中MMPs与TIMPs的合成与降解存在一定的比例关系，当人体组织由于某种刺激而发生炎症反应时，会导致MMPs的分泌增多，造成ECM和基底膜发生降解，同时其抑制因子TIMPs的含量会相应升高对机体起到保护的作用。本研究结果显示：牙周基础治疗结束后，MMP-3，TIMP-2的总量与治疗前对比明显降低，治疗前后MMP-3，TIMP-2的总量与正常对照组MMP-3，TIMP-2的总量对比有明显差异。同时，本研究表明：牙周基础治疗完成后，MMP-3和TIMP-2的比值与治疗前对比明显降低，治疗结束后MMP-3与TIMP-2的比值高于正常对照组MMP-3与TIMP-2的比值。而本实验也证实：在系统的牙周基础治疗完成后，MMP-3和TIMP-2的含量与治疗前对比显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。

本研究通过检测慢性牙周炎患者牙周基础治疗前后GCF中MMP-3和TIMP-2的含量以及MMP-3与TIMP-2的比值与正常对照组进行对比，本实验结果表明慢性牙周病患者牙周基础治疗前后GCF中MMP-3，TIMP-2的含量以及MMP-3与TIMP-2的比值有显著差异(P<0.05)。因此，本实验说明MMP-3与TIMP-2的比值可以用来客观评价牙周组织的健康状况和疾病状态，牙周病变的治疗效果以及监控慢性牙周病的病情发展。

[1]TüterG，KurtiB，SerdarM，etal．EffectsofphaseIperio-dontaltreatmentongingivalcrevicularfluidlevelsofmatrixmetalloproteinase-3andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1[J]．JClinPeriodontol，2005，32(9):1011-1015

[2]Bikredal一HnasenH.RoleofmatrixmetallpoorteinasesninmnaPeriodontaldiseases[J].JPeriodoniol,1993,64(5):474

[3]LoosBG，TjoaS．Host-deriveddiagnosticmarkersforperi-odontitis:Dotheyexistingingivalcrevicefluid[J]．Pe-riodontol,2005，39: 53-57

[4]SodekJ,OverallCM.MatrixmetalloPorteinasesinPeriodontaltissueremodelling[J].MartixSuPPI,1992,1:352

[5]王新，何宝江，周昱，腹腔镜胆囊切除术后套管部位疝3例分析[J].黑龙江医药科学，2011,34(5):46

[6]SoellM,ElkaimR,TenenbaumH.Matrixmetalloproteinases,andtheirtissueinhibitorsingingivaandgingivalcrevicularfluidfromperiodontitis-affectedpatients[J].JDentRes, 2002, 81(3):174

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[8]刘友良,唐瞻贵.基质金属蛋白酶-9及基质金属蛋白酶抑制剂-1在口腔鳞状细胞癌中的表达研究[J].口腔医学，2001,30(2)：80-81

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[10]姜彤，王凯丽.派力奥软膏联合vitapex对牙周牙髓联合病变的有效性及安全性研究[J].黑龙江医药科学，2016,39(5)：85-86

Changes of MMP-3 and TIMP-2 levels in gingival crevicular fluid before and after treatment in patients with chronic periodontitis

ZHUJian-hua,JIAHui-min,LIUJi-guang,LIJia-wei,MIAOYi-bin

(The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective: To explore the basis through the detection of chronic periodontitis before and after treatment in gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase factor -3 (MMP-3) and the level of matrix metalloproteinase inhibitor -2 (TIMP-2) and the ratio of MMP-3/TIMP-2. Methods: GCF selected 15 teeth with clinically diagnosed patients with chronic periodontitis oral 30 severe tooth the week's disease (GCF) samples, and 15 cases of healthy control group GCF samples of 30 teeth in the oral cavity of the patient who suffered from MMP-3 and TIMP-2, were detected in gingival crevicular fluid by ELISA assay, The ratio of MMP-3/TIMP-2. The GCF was collected and the clinical examination should be at the end of treatment and 4 weeks after treatment. Results: after basic periodontal treatment and treatment of total MMP-3 and TIMP-2 decreased significantly than before (P<0.05),andtheamountofTIMP-2MMP-3beforeandaftertreatmentcomparedwiththecontrolgroupweresignificantlydifferent(P<0.05),treatmentaftertreatmentwithTIMP-2andMMP-3ratiothanbeforesignificantlydecreased,andhigherthanthatinthenormalcontrolgroupandMMP-3.MMP-3ratioofTIMP-2andthecontentofTIMP-2wassignificantly.Conclusion: MMP-3 and TIMP-2 levels in patients with chronic periodontitis (P<0.01)andtheratioofMMP-3toTIMP-2maybeusedasasensitiveindexformonitoringtheconditionofchronicperiodontitis(GCF).

chronic periodontitis；subgingival scaling and root planing；gingival crevicular fluid；MMP-3；TIMP-2；ELISA

佳木斯大学科技创新项目，编号：YM2016 078。

朱建华(1959～)女，黑龙江佳木斯人，学士，教授，硕士研究生导师。

刘继光(1961～)男，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail:13633645349@163.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0065-03

2016-11-12)