山茱萸多糖对AD大鼠学习记忆能力的影响①

邓文伟，邓 萌，杨广禄，王淑英，孙国志，李 尧，张 辉，姚海涛，王景霞

(1. 佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007)

山茱萸多糖对AD大鼠学习记忆能力的影响①

邓文伟1，邓 萌1，杨广禄1，王淑英2，孙国志2，李 尧2，张 辉2，姚海涛2，王景霞2

(1. 佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007)

目的：观察丝山茱萸对AD大鼠学习记忆功能的影响。方法：清洁级Wistar大鼠共75只；体重200～250g，随机分为6组：(1)假手术组，10只；(2)青年组，13只；(3)Aβ对照组，13只；(4)阳性对照组，13只；(5)水煎剂组，13只；(6)多糖组，13只；标准统一喂养，饮水自由。除青年组外，其他各组大鼠连续42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg)，之后建立AD大鼠模型，采用淀粉样蛋白1-40(Bamyloid,1-40) 海马立体定向微量注射方法；morris水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力。结果：A-42注射前后大鼠行为学变化:造模前各组大鼠寻找平台时间、目标项限停留时间无显著性差异，造模后,组间比较(P<0.01),有统计学意义;对照组与模型组比较(P<0.01),有统计学意义;山茱萸多糖组与模型组比较(P<0.01), 山茱萸水煎剂组与模型组比较(P<0.01)。结论：山茱萸多糖可改善AD大鼠学习记忆能力。

山茱萸多糖；AD；大鼠

老年性痴呆(Alzheimer’sdisease，AD)是继心脏病、肿瘤和中风之后的第四大死亡原因[1]。为防治AD，学者们进行了大量的研究工作，并应用叶酸、多奈呱齐、卵磷脂、银杏提取物等药物治疗AD。在治疗过程中由于药物作用的特异性、有效性及毒副反应，使得药物在临床应用中受到限制[2]。近年来在治疗AD的药物上，中药取得了一定的成果，山茱萸作为补益肝肾药，使载于《神农本草经》。山茱萸的主要成分有单糖、多糖、苷类、有机酸、环烯醚萜类、皂苷、蒽醌、黄酮、甾体、三萜、内酯等多种成分[3～7]，现有研究结果表发现山茱萸具有抗氧化、降血糖、免疫调节及抗癌等作用[8，9]，且毒副作用小，与治疗AD的药物多奈呱齐在提高AD患者操作性总有效率方面，差异无显著性[10]。本实验采用海马注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，应用morris水迷宫检测山茱萸对AD大鼠学习记忆功能的影响。

1 实验动物和药品

清洁级Wistar大鼠75只，购自大连医科大学动物实验中心，体重200～250g，随机分为6组：(1)假手术组，10只；(2)青年组，13只；(3)Aβ对照组，13只；(4)阳性对照组，13只；(5)水煎剂组，13只；(6)多糖组，13只；标准统一喂养，饮水自由。除青年组外，其他各组大鼠连续42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg)，这后进行手术。术前进行水迷宫检测，10%的水合氯醛腹腔注射进行麻醉(380mg/kg)，将大鼠固定在脑立体定位仪上，前囟后3.8mm，中线右侧2mm，进针至距脑表面3mm，缓慢注射，用时2min，假手术组注射2μL生理盐水，Aβ对照组、给药组和阳性对照组大鼠注射凝聚态Aβ1-40(10μg·μL-1) 2μL，留针10min后缓慢拔出，切口缝合，让大鼠在低温环境下苏醒。连续经胃灌服给药30d，于最后一次给药后次日，行水迷宫检测。

2 方法

2.1 大鼠行为学指标的检测方法

检测空间学习记忆能力的指标采用Morris水迷宫法。实验在隔音的房间内进行，实验中水池、光源、鼠笼、操作者的位置等因素均要保持不变。实验采用直径120cm，高50cm的圆形水池，水迷宫上方摄像系统与电脑相连，预先在水池中注入含奶粉的清水，水深约30cm，温度(21±1.5)℃，奶粉加入量以看不见平台为准(高出平台2cm)。以水池4个象限作为大鼠的入水点，将平台置于入水点之外的任意象限的中央，每只动物实验中保持平台位置不变，放入水中时要面向池壁，记录大鼠从入水到找到平台所游过的路径及需要的时间(即逃避潜伏期)作为学习和记忆的成绩、记录大鼠在水中寻找平台路线图。每次实验设定120秒为最长游泳时间限制，若动物在120秒之内找到平台，让其在平台停留30秒，若找不到平台则将大鼠引至平台并停留30秒，以强化其记忆。训练6d，每天5次，之后24h内进行空间探索实验，记录大鼠在60秒内跨越平台相应位置的次数等，此数据作为空间探索能力的指标。Morris水迷宫实验检测在D-半乳糖注射42d后、手术后7d(给药前)和给药后分别进行，Aβ注射后大鼠学习记忆成绩下降30%以上则视为AD造模成功，本实验中共有53只大鼠达到要求，分别用于实验组(多糖组和水煎剂组)、阳性对照组和Aβ对照组。

山茱萸购、山茱萸多糖、盐酸多奈哌齐、Aβ1-40分别购于佳木斯医药采购供应站(产地浙江省)、宁波德康生物制品有限公司、济南德信佳生物科技有限公司和上海瑞奇生物科技有限公司。干燥粉碎后的茱萸果实制备水煎剂，加入6倍体积的蒸馏水，浸泡24h后2次煎煮，滤液合并，2次抽提，浓缩成膏状，使用前用双蒸水将多糖及水煎剂分别配置成0.057g生药/mL的溶液、Aβ制成10μg·μL-1浓度的溶液，密封后37℃孵育7d，成絮状凝聚态之后使用。EB、乙醇、异丙醇、氯仿、无水乙醇、乙醚、苯酚、浓硫酸等为国产分析纯。

2.2 统计学方法

3 结果

3.1 测定造模前、后及给药后大鼠逃避的潜伏期

大鼠连续42d腹腔注射D-半乳糖后(手术前)进行Aβ注射(手术后)、给药30d后(给药后)，分别进行大鼠在定位航行中的逃避潜伏期(寻找平台时间)检测，见表1。

表1 大鼠逃避潜伏期的变化及山茱萸对其影响±s，s)

注：与手术前比较※P<0.05，※※P<0.01;与青年组比较■P<0.05，■■P<0.01；与假手术组比较△P<0.05，△△P<0.01；与造模后比较#P<0.05，##P<0.01；与Aβ对照组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；与阳性对照组比较★P<0.05，★★P<0.01；与水煎剂组比较□P<0.05，□□P<0.01。

由表1 可见，与青年组比较，手术前(注射D-半乳糖之后)和手术后(注射Aβ后，模型制作结素后)大鼠逃避潜伏期均延长(P<0.01)，手术造模后大鼠的潜伏期也较手术前延长(P<0.01)，与假手术组比较， 在Aβ注射前各组大鼠逃避潜伏期没有明显差异(P>0.05)；Aβ对照组、阳性对照组、多糖组和水煎剂组在造模后潜伏期无明显差异(P>0.05)；阳性对照组、多糖组和水煎剂组大鼠在给药30d后潜伏期明显缩短(P<0.01)，与Aβ对照组比较，阳性对照组、多糖组和水煎剂组差别显著(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，三组之间比较差异无统计学意义，且各组均未达到手术前及青年大鼠水平。

3.2 大鼠造模前后及给药后空间探索实验的测定

3.2.1 大鼠经过平台的次数

AD造模前后在空间探索实验中大鼠跨越平台次数检测结果，见表2。

表2 AD模型大鼠跨越平台的次数及山茱萸对其影响±s)

由表2可见，除青年组外，其他各组大鼠跨越平台次数明显减少(P<0.05)；造模后Aβ对照组、阳性对照组、水煎剂组和多糖组大鼠跨越平台次数组间没有显著差别(P>0.05)，但均明显少于术前(P<0.01)，与假手术组比较均有显著差异(P<0.01)；结果显示在手术前各组间无显著性差别；阳性对照组、水煎剂组和多糖组大鼠跨越平台的次数均显著增加，与Aβ对照组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，比较三组之间结果无明显差异，且三组均没达到术前和青年组水平(P>0.05)。

3.2.2 大鼠经过有效区的次数

AD模型制作前后大鼠在空间探索实验中经过有效区的次数，见表3。

表3 大鼠经有效区的次数以及山茱萸对其影响±s)

由表3可知，除青年组外，其他各组大鼠经有效区的次数均明显减少(P<0.01)；造模后Aβ对照组、阳性对照组、多糖组和水煎剂组大鼠经有效区的次数均显著少于手术前(P<0.01)，且均较假手术组有明显减少(P<0.05)；阳性对照组、水煎剂组和多糖组大鼠经过有效区的次数均明显增加(P<0.01)，亦比Aβ对照组显著增加(P<0.01)；其中多糖组与水煎剂组大鼠较阳性对照组明显降低(P<0.05)，但三组比较结果显示均未达到青年组和手术前大鼠水平(P>0.05)。

3.3 大鼠游程比和原象限时间比及给药后的变化

大鼠在原象限游泳距离与总路程之比值(游程比)及在给药后的变化检测结果，见表4。

表4 AD模型大鼠游程比及山茱萸对其影响±s,%)

由表4可见，假手术组、Aβ对照组、阳性对照组、多糖组和水煎剂组大鼠游程比较青年组均明显降低(P<0.05)；模型制作后Aβ对照组、阳性对照组、多糖组和水煎剂组大鼠组间游程比无显著差异(P>0.05)，但均较手术前显著降低(P<0.01)，且与假手术组比较有显著差异(P<0.01)；多奈哌齐、多糖和水煎剂均能显著提高大鼠游程比(P<0.01)，较Aβ对照组显著提高，但三个用药组之间比较无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

Morris水迷宫是目前最广泛使用评价空间学习与记忆能力的方法，主要针对与海马结构相关的记忆功能进行检测，尤其适用于AD动物模型。实验结果显示，相比于对照组和山茱萸干预组，模型组的大鼠上台的潜伏期延长，穿越原平台的次数、目标象限游泳时间和游程比均未下降，表明Aβ损害了大鼠的保持能力和空间记忆获取能力，证明造模成功；与模型组比较，山茱萸干预组大鼠上台的潜伏期显著缩短，穿越原的平台次数、目标象限游泳时间和游程比都有较大提高，提示山茱萸对Aβ导致的AD大鼠的保持能力和空间记忆获取能力有较大的改善，能改善AD大鼠学习记忆的能力。

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1.黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2014-256；2.黑龙江省教育厅科研项目，编号：12541791；3.黑龙江省中医药管理局，编号：ZHY16-018。

邓文伟(1963～)男，黑龙江佳木斯人，学士，教授，硕士研究生导师。

王景霞(1964～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail:WWX1964@163.com。

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1008-0104(2017)03-0032-03

2017-04-06)