检测尿液中的USP9Y-TTTY15RNA对前列腺癌的早期诊断①

罗振国，李淑奎，陶 然，邓勇泉，迟宝进，杜从林

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科,黑龙江 佳木斯 154003)

检测尿液中的USP9Y-TTTY15RNA对前列腺癌的早期诊断①

罗振国，李淑奎，陶 然，邓勇泉，迟宝进，杜从林

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科,黑龙江 佳木斯 154003)

目的:通过检测尿液中的USP9Y-TTTY15RNA 的含量，判断其是否可以用于前列腺癌的早期诊断。方法:收集2014-10～2016-02前列腺癌患者40例、前列腺增生患者40例和健康男性40例。应用实时荧光定量PCR法检测受试者前列腺按摩后尿液中的PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的含量。计算USP9Y-TTTY15RNA在各组患者中的相对浓度。结果:USP9Y-TTTY15RNA在各组中均有表达，但前列腺癌中表达最多，与前列腺增生组和健康男性组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:USP9Y-TTTY15RNA在各组中均有表达，但在前列腺癌中表达最高，可作为前列腺癌的特异性标记物，可用于前列腺癌的早期临床诊断。

前列腺癌;USP9Y-TTTY15;早期诊断;肿瘤标记物

前列腺癌的发病率有着明显的地理和种族差异。根据2013年美国最新的癌症统计报告，美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为了危害男性健康的第一位肿瘤[1]。我国前列腺癌发病率相对较低，然而随着近年来人们生活习惯和饮食结构的改变，前列腺癌的发病率在我国呈逐年升高的趋势。

98%的前列腺癌是起源于腺细胞的腺癌，其最终确诊依赖于穿刺活检以及术后病理。然而穿刺后所取得的前列腺组织量很少，而且现有的辅助检查手段往往无法对早期前列腺癌进行精准的定位，致使临床工作中不能实现对穿刺取得的少量细胞或腺体进行分析与准确诊断。目前公认的前列腺癌筛查方法是直肠指检(DRE)联合血清前列腺特异性抗原(PSA)[2]，而对筛查结果异常的人群行前列腺的穿刺活检，总体检出率为 27.4%[3]。实验证实，一些恶性肿瘤在其癌变的早期，肿瘤相关的分子生物学指标已有显著异常表现，因此，研究重点已逐渐转向分子病理领域。

USP9Y-TTTY15融合基因是我国学者近年来发现的具有潜在临床应用价值的前列腺癌标记物[4]。USP9Y-TTTY15融合基因不表达融合蛋白，而是作为一个lncRNA发挥生物学作用。本次实验旨在测定USP9Y-TTTY15RNA在前列腺癌组、前列腺增生组和正常男性组中的表达，以判定USP9Y-TTTY15RNA是否可以用于前列腺癌的早期诊断。由于前列腺按摩后脱落的前列腺细胞数量不等，所以本次实验测定PSAmRNA用于实验校正[5]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014-10～2016-02前列腺按摩后尿液共120例，包括：①前列腺癌患者40例，年龄61～92岁，平均78岁，均为经前列腺穿刺活检和术后病理回报为前列腺癌的患者；②前列腺增生患者40例，年龄69～88岁，平均81岁，均为临床诊断明确且未经手术的患者；③健康男性40例，年龄22～40岁，平均32岁，均为无肿瘤及其他前列腺疾病相关疾病的患者。不符合尿液标本收集与纳入实验的条件包括：①前列腺炎症患者；②患者留置导尿管或膀胱造瘘管；③收集到的尿液絮状物多。采集尿液前，充分和患者沟通，患者知情同意。

1.2 主要试剂和实验方法

1.2.1 主要试剂：UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、焦碳酸二乙酯、琼脂糖、溴化乙锭溶液、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、DEPC水、PCR管、荧光定量PCR板、荧光定量型封膜、荧光定量PCR8联管&盖、SGExcelFastSYBRMixture(WithROX)、PBS粉末装、taq酶、DNTP等试验相关试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2．2 引物设计及合成。通过NCBI查询PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的rs号，由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成引物。PSAmRNA正义：AGTCTGCGGCGGTGT，反义：TGAGGTCGTGGCTGGAGT；USP9Y-TTTY15正义：CATCACCTGGAGTCCGTGTAAG，反义：CCTACTGGAGAGCCATGAGTG。合成的引物OD值为2.0，经HAP方法纯化后通过质谱检测证实为合格引物。

1.2.3RNA提取及cDNA合成。收集前列腺按摩后的第一次排尿前中段尿液约20mL，密封于50mL无菌离心管内，迅速将尿液至于冰盒冷却并送往实验室[6]，高速离心(4500g×15min，4℃)，弃去尿液上清，并用 1×PBS清洗2遍后再次离心(4500g×10min，4℃)，弃上清液，用UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取尿沉渣中的RNA。用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒及引物合成PSA和USP9Y-TTTY15的cDNA，并对cDNA进行PCR反应及电泳验证。

1.2.4 染料法荧光定量PCR测定尿液中PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的含量。应用AB7300荧光定量PCR仪对合格的cDNA样本进行扩增，加入SGExcelFastSYBRMixture(WithROX)等相关试剂，根据实验测得的CT值计算USP9Y-TTTY15RNA的相对初始浓度，最终结果用2Ct(PSA)-Ct(USP9Y-TTTY15)×1000表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件对实验数据进行统计分析。应用Wilcoxon秩和检验对统计结果进行分析，以P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

通过染料法荧光定量PCR检测，我们发现融合基因USP9Y-TTTY15RNA在所有尿沉渣样本中均有表达，Ct值均在22～26之间。计算USP9Y-TTTY15RNA初始浓度后，应用SPSS17.0分别对前列腺癌组、前列腺增生组和健康男性组的尿沉渣样本数据进行正态性检验发现P分别为 0.006和 0.020和0.012，提示USP9Y-TTTY15RNA在各组中呈偏态性分布。运用Mann-WhitneyU-test非参数检验，发现USP9Y-TTTY15在前列腺癌患者尿沉渣中表达量明显高于前列腺增生组和健康男性组，P=0.009。而前列腺增生组和健康男性组之间无明显差异，P=0.211，见表1。

表1 尿沉渣中USP9Y-TTTY15的相对初始浓度

*前列腺癌组与其他两组相比，P<0.05。

以上结果证实了融合基因USP9Y-TTTY15不仅能够在前列腺肿瘤患者尿沉渣中被检测到，而且表达量明显高于前列腺增生组和健康男性组。由此推断，该融合基因在前列腺癌的发生发展中发挥着重要的危险因子作用，可用于前列腺癌的早期诊断。

3 讨论

世界范围内，我国是前列腺癌的低发国家，但随着人口老龄化时代的到来，疾病筛查意识的提高，新发的前列腺癌患者逐年升高。1998～2008年中国男性前列腺癌发病率的年均增加比例为12. 07%，2008年中国男性前列腺癌粗发病率为11.00/10万[7]。目前诊断早期前列腺癌的最常见手段是经直肠超声引导下前列腺穿刺活检获取组织标本行病理检查。前列腺癌的筛查主要通过直肠指检和血清前列腺特异抗原(Prostate-specific-antigen，PSA)水平，但大部分的前列腺癌患者都不能实现早期诊断。自从1980年PSA第一次从血液中定量测出以来，PSA被广泛应用于前列腺疾病的诊断，但其对前列腺癌诊断的特异性低和存在灰区一直在被关注和讨论。国内的一组数据显示血清总PSA(tPSA)介于4～10ng/mL时，应用5区13针法前列腺穿刺活检的阳性率仅为15.9%[8]。同时tPSA也受年龄和前列腺体积的影响，Zhi-Yong等研究表示确诊无前列腺癌的前列腺增生患者年龄≥80岁时，tPSA为0～8.0ng/mL[9]。为此寻找新的前列腺癌特异性标记物成为了近年来研究的热点。

融合基因是指两个或多个基因的编码区首尾相连后形成的新的基因。融合后的基因共用同一套调控序列，主要包括启动子、增强子和终止子等。USP9Y(ubiquitinspecificpeptidase9,Y-linked)位于Y染色体长臂1区1带2亚带，包含49个外显子。表达的产物是泛素特定肽酶9。TTTY15(testis-specifictranscript,Y-linked15)位于Y染色体长臂1区1带1亚带，包含4个外显子。转录产物为Y连锁的睾丸特异转录因子15，是一个非编码RNA。USP9Y与TTTY15融合后形成的融合基因为USP9Y-TTTY15。Ren等通过RNA测序分析确定了USP9Y-TTTY15与前列腺癌存在相关性[10]，但国内关于USP9Y-TTTY15表达量的研究较少。本文分别测定USP9Y-TTTY15RNA在前列腺癌组、前列腺增生组和正常男性组的含量，进一步明确USP9Y-TTTY15与前列腺癌的关系。

本次试验收集的样本是前列腺按摩后的尿液，测得的数值用PSAmRNA进行校正。前列腺按摩后的尿液中除了含有前列腺脱落细胞，还含有尿路上皮细胞等其他脱落细胞，而PSAmRNA在前列腺细胞中特异性的表达，故需要通过检测PSAmRNA的含量尿液中脱落的总前列腺细胞进行校正。本次试验证实USP9Y-TTTY15在前列腺癌中呈高表达，在其他两组中低表达，差异具有统计学意义。所以USP9Y-TTTY15可以作为前列腺癌的特异性标记物，用于前列腺癌的早期诊断。鉴于PSAmRNA的低特异性，USP9Y-TTTY15有着广泛的应用前景，尤其对于血PSA介于4～10ng/mL时，联合检测USP9Y-TTTY15具有重大意义，如可以增加前列腺穿刺活检的阳性率，避免不必要的前列腺穿刺等，但仍需后续的相关实验研究。根据尿液中USP9Y-TTTY15mRNA的具体含量来辅助评定临床中诊断证据不足或者难以诊断的患者是否可行前列腺癌的相关治疗，完成前列腺癌的早发现、早诊断、早治疗，对提高患者治愈率和预后生活水平有重要意义。

综上所述，前列腺癌病人经前列腺按摩收集到的尿液中可以检测到USP9Y-TTTY15融合基因的高表达，可以作为前列腺癌的早期诊断标记物之一，而且尿液检测具有无创性的特点。联合PSA检测的结果，或许对PSA水平增高但穿刺活检为阴性的患者有特殊的意义，可以评定此类患者是否需要再一次的穿刺活检，但相关数据仍需进一步的实验加以验证。

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黑龙江省自然科学基金项目，编号：D201225。

罗振国(1964～ ) 男，黑龙江宝清人，学士，教授，主任医师，硕士研究生导师。

陶然 (1986～ )男 ，黑龙江佳木斯人，硕士,住院医师。 E-mail：524808121@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0030-02

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