细胞外基质磷酸糖蛋白对体外细胞生物学行为的影响①

李善昌，董 波，曲学延，闫 磊，宁尚波，刘占领

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳术斯 154002)

细胞外基质磷酸糖蛋白对体外细胞生物学行为的影响①

李善昌，董 波，曲学延，闫 磊，宁尚波，刘占领

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳术斯 154002)

目的：探讨细胞外基质磷酸糖蛋白对体外细胞生物学行为的增殖影响及基因表达。方法:构建含细胞外基质磷酸糖蛋白基因的质粒后稳定转染细胞株，利用RT-PCR检测转染后细胞株hMEPE蛋白表达结果。基于蛋白表达结果基础上通过RT-PCR检测p53基因的表达水平，MTT实验检测细胞增殖水平。结果：RT-PCR结果显示与转染空载体细胞相比p53基因在转染目的基因细胞表达增高。MTT结果有统计学意义(P<0.05),显示转染后的hmepe细胞株较转染空载体细胞相比增殖能力明显提高。结论：细胞外基质磷酸糖蛋可以通过p53信号通路提高细胞增殖能力。

细胞外基质磷酸糖蛋白;增殖

细胞外基质磷酸糖蛋白(matrixextracellularphosphoglycoprotein,MEPE)最早是2000年由RowePS等人最早在肿瘤源性骨软化症(tumorinducedosteomalacia，TIO) 的肿瘤中提取得到的，并且将其命名为MEPE，随后学者们将其定位为人的第4号染色体(4q21.1)，目前公认MEPE是肿瘤细胞分泌的磷酸蛋白因子[1]。MEPE蛋白作为小型N端连接整合素家族蛋白 (smallintegrin-bindingligandN-linkedGlycoproteins,SBLING)的一员，其C端有一段酸性富含丝氨酸-天冬氨酸MEPE相关基序(acidicserine-aspartate-richMEPE-associatedmoti,fASARMmotif)[2，3]。

近10年来的实验结果可分析出SIBLINGs家族成员通过此序列与细胞表面整合素的结合来介导细胞黏附及信号传导[4]，参与基质的钙化，骨质、牙齿的形成，与细胞增殖能力有密切关系。不管是上皮来源还是间充质来源的肿瘤当中均能发现较高水平的SIBLING家族蛋白的表达。目前大量的研究发现，他们可参与肿瘤发展的许多阶段，包括肿瘤细胞的初期的黏附增殖、以及局部侵袭和后期细胞外基质的降解、肿瘤性血管的发生、逃避宿主免疫、肿瘤的远处转移(尤其是骨转移)、以及各种肿瘤组织病理性钙化的形成[5]。本实验通过相关检测研究MEPE蛋白对肿瘤细胞增殖的生物学行为的影响，以及其基因信号通路的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株、质粒MEPEcDNA及质粒pLEGEP-N(购于BDBiosciencesClontech公司)；293T细胞株(中科院上海细胞研究所)；大肠杆菌E.coliDH5T(本实验室提供)。PBS(1X)(吉诺生物医药技术有限公司)；DMEM高糖培养基(Sigma公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；PBS(Hclone公司)；RNAisoPlus(宝生物工程有限公司);LipofectamineTM2000;G-418Sulfate(GIBCO)。QIAprep质粒提取试剂盒(Qiagen公司)；PCR产物纯化Geneclean11试剂盒(Cat# 1001-400)(BIO101公司)；T4DNA连接酶(购自Takara生物公司)。

1.2 方法

1.2.1PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定

扩增MEPEcDNA全长，其扩增引物:上游引物:5′一CATATGAAGCTGAATGAAGAT- 3；下游引物: 3′-GGATCCTTACATTTGGGGGAGATG- 3′，PCR扩增的目的基因经NdeI与BamHI双酶切后，将pLEGEP-N1载体进行同样酶切处理，随后将前者克隆到后者得到融合质粒表达，通过感受态大肠杆菌DH5T挑去单克隆进行筛选，选出一个或两个阳性克隆进行PCR测序，并进行序列及读码框架结果正确与否的鉴定。

1.2.2 稳定转染细胞株构建

细胞生长状态优良且融合率达 90%以上时进行转染。按照说明手册将细胞转染至6孔板加入胰酶消化48h后制备细胞悬液，稀释细胞悬疑至原有悬液的10倍，将其铺于96孔板内，每孔分别加入600ug/mLG418完全培养基进行克隆筛选，常规培养4周后克隆阳性细胞进行鉴定并扩增培养冻存。

1.2.3RT-PCR检测

按照已购买的RNA提取试剂的操作说明书 ,用Trizol提取细胞总RNA。实验之前所用器具用DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶。RT-PCR检测转染细胞中p53基因的表达。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。

1.2.4MTT检测增殖能力

293T细胞生长密度至80%时常规胰酶消化、计数 ,接种2000～3000个细胞至96孔板中，目的基因组、空载体组 ,每组 3个复孔。置于培养箱中培养。细胞培养至 2、4、6及 8d后 ,加入20μLMTT(浓度为5mg/mL)继续培养4h，终止培养，小心吸尽培养基。每孔加入150μLDMSO，室温下振荡10min，在酶标仪上设定波长490nm测定并记录各孔吸光度值。

图1pLEGFP一N1-mepe转染细胞及pLEGFP一N1转染细胞RT-PCR电泳图

a：DL5OODNAmarker:b、c：空载体细胞及转染目的基因的GAPDH表达;d转染MEPE质粒细胞中MEPE表达;e转染EGFP细胞中MEPE表达。

2 结果

2.1 稳定转染细胞株的检测

稳定转染细胞株后提取转染细胞总RNA进行PCR检测，电泳图结果显示两组细胞90bp附近均有GAPDH扩增条带出现;目的基因细胞转染后扩增条带出现在120bp;空载体组在120bp处无扩增条带出现，证明转染成功，见图1。

2.2RT-PCR检测相关因子表达情况

从产物电泳图比较三种基因在两种细胞中的不同表达,见图2。

2.3MTT检测细胞增殖结果

MTT检测结果显示转染MEPE的293T细胞其增殖数量增加近1.3倍，见表1。

图2 转染MEPE及空载体细胞中基因表达

a.DL500DNAmarker;b. 转染MEPE细胞中GAPDH表达 ;c.转染空载体细胞中GAPDH表达;d.DL500DNAmarker;e. 转染空载体细胞中p53 表达 ;f. 转染MEPE细胞中p53表达。

表1 MTT法检测MEPE及EGFP空载体转染293T 细胞增殖指数

注：P<0.05

3 讨论

鉴于SIBLINGs家族成员在正常生理情况下与成骨细胞、破骨细胞发挥功能密切相关，大量研究人员推测它与肿瘤骨转移也必然有着千丝万缕的联系。近几十年来的报道显示肿瘤发展的许多阶段包括肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、血管生成都与SIBLINGs家族蛋白密切相关。KaluU.E等人报道某些SIBLING家族成员蛋白以及其相关的基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤细胞表达水平提高，并且与肿瘤的不同发展阶段密切相关。目前已知的三种蛋白包括BSP,OPN和DMP1，与MMPs有很高的亲和力，很容易形成SIBLING-MMPs复合体从而行使多种功能，例如肿瘤的侵袭和转移[6]。CuiR等[7]研究显示如果刻意阻断OPN与血管发生的关键因子整合素受体αvβ3相互作用时，可见大鼠体内的肺癌细胞生长缓慢甚至停滞。SharpJA等[8]人研究发现注射转染中的IBSP基因到裸鼠体内可使其体内乳腺癌MDA-MB231细胞增殖水平提高，显示骨唾液蛋白(BSP)能够加剧肿瘤发生。通过对以上体内外的实验结果分析,我们可以证实SIBLING家族成员蛋白对肿瘤细胞有较大的影响,本实验通过检测结果证明MEPE蛋白表达水平的对细胞增殖的生物学特性的影响,且PCR电泳图结果证实其作用机制是通过p53蛋白信号通路实现的。临床上肿瘤具有增殖失控，侵袭，转移等共性，这些特点是治疗肿瘤致命的要点，MEPE的研究成果为探索癌的发生机制，早期诊断及预后判断标志提供了多方面的线索，大大提高了对癌症早期发现几率，抓住治疗时机，为恶性肿瘤的基因治疗奠定了基础。虽然目前基因治疗尚未在临床普及,但大量研究显示此种疗法具有优良的应用前景。此外对于MEPE对肿瘤细胞的其他生物学行为的影响及分子机制的研究还不完善，有待进一步体外实验的探索。

[1]RowePS,DeZoysaPA,DongR,etal.MEPE,anewgeneexpressedinbonemarrowandtumorscausingosteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

[2]BellahceneA,CastronovoV,OgburekeKE,etal.Smallintegrin-bindingN-linkedGlycoproteins(SIBILINGs):multifunctionalproteinincancer[J].NatRevCancer, 2011, 8(3):212-226

[3]FisherLW,FedarkoNS.SixgenesexpressedinbonesandteethencodethecurrentmembersoftheSIBLINGfamilyofproteins[J].ConnectTissueRes, 2009, 44(1): 33-40

[4]GVKulkarni,BChen,JPMalone,etal.PromotionofselectivecellattachmentbytheRGDsequenceindentinematrixprotein1[J].ArchOralBiol,2000，45(6)：475-484

[5]SharpJA,WalthamM,WilliamsED,etal.TrensfectionofMDA-MB-231humanbreastcarcinomacellswithBonesialoprotein(BSP)stimulatesmigrationandinvasioninvitroAndgrowthofprimaryandsecondarytymorsinnudemice[J].ClinExpMetastasis，2004，21：19-29

[6]KUOgburekeandLWFisher.ExpressionofSIBLINGsandtherPartnerMMPsinsalivaryglands[J].JDentRes,2004，664-670

[7]GuiR.Abrogationoftheinteractionbeteeenosteopontinandαvβ3integrinreducestumorgrowthofhumanlungcancercellinmice[J].LungCancer，2007，57:302-310

[8]ZhiyongMi,HongtaoGuoandPaulCKuo.Identificationofosteopontin-dependentsignalingpathwaysinamousemodelofhumanbreastcancer[J] .BMCResearchNotes, 2009, 2: 119-12

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12521553。

李善昌(1969～ )男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。

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1008-0104(2017)03-0010-02

2017-03-05)