尼美舒利联合奥沙利铂对食管癌大鼠移植瘤生长及免疫功能的影响

李 萌，何 勇，肖 飞，田远耀（.安徽医科大学附属巢湖医院药剂科，安徽巢湖 38000；.池州市人民医院药剂科，安徽池州 47000）

尼美舒利联合奥沙利铂对食管癌大鼠移植瘤生长及免疫功能的影响

李 萌1＊，何 勇2，肖 飞1，田远耀1（1.安徽医科大学附属巢湖医院药剂科，安徽巢湖 238000；2.池州市人民医院药剂科，安徽池州 247000）

目的：研究尼美舒利联合奥沙利铂对食管癌大鼠移植瘤生长及免疫功能的影响。方法：将大鼠随机分为模型组（ig羧甲基纤维素钠溶液+尾iv 5%的葡萄糖注射液）、尼美舒利组（ig 20mg/kg）、奥沙利铂组（尾iv 13.6mg/kg）及联用组，每组10只，ih食管癌Eca109细胞建立移植瘤模型。建模成功后各组大鼠按相应方式给予相应药物，ig每天1次，尾iv每4 d 1次。8周后处死大鼠，测量各组大鼠瘤体积和瘤质量，计算抑瘤率，检测血清中肿瘤标志物（CEA、CYFRA21-1、SCCAg）含量、外周血中免疫细胞（CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞）百分比。结果：与模型组比较，其余3组大鼠瘤体积和瘤质量减小（P＜0.05）；肿瘤标志物含量减少（P＜0.05）；尼美舒利组大鼠CD3+、CD4+T细胞和NK细胞百分比增高，CD8+T细胞百分比降低（P＜0.05）；奥沙利铂组和联用组大鼠CD3+、CD4+T细胞和NK细胞百分比降低，CD8+T细胞数量百分比增高（P＜0.05）。与尼美舒利组和奥沙利铂组比较，联用组大鼠抑瘤率增加（P＜0.05），肿瘤标志物含量减少（P＜0.05），免疫细胞百分比较尼美舒利组降低、较奥沙利铂组增高（P＜0.05）。结论：尼美舒利能增强奥沙利铂对食管癌的抑瘤作用，降低奥沙利铂对大鼠免疫功能的抑制程度。

食管癌；尼美舒利；奥沙利铂；免疫功能；大鼠

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已经发展至中晚期，需要通过静脉化疗来延缓病情发展、延长患者生存时间[1]。奥沙利铂是临床常用的食管癌化疗药物，对癌细胞具有杀伤效应，但是受到其胃肠道反应、神经毒性和骨髓移植等不良反应的影响，导致患者预后并不理想[2]。近年来关于消化道恶性肿瘤的研究证实，环氧合酶2（COX-2）与肿瘤的发生和发展密切相关，COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，其表达量升高能促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。尼美舒利是新型非甾体类抗炎药物，能够高选择性抑制COX-2的活性[3]。因此，本文设计研究了尼美舒利联合奥沙利铂对食管癌大鼠移植瘤生长及免疫功能的影响，以期为提高奥沙利铂的临床疗效提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7600全自动生化分析仪（日本日立公司）；CytoFLEX流式细胞分析仪（美国贝克曼库光特公司）；Heraeus Pico 21 Centrifuge离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 药品与试剂

尼美舒利片（广东惠德勒药业有限公司，批号：153924681，规格：每片0.1 g）；奥沙利铂甘露醇注射液（辰欣药业股份有限公司，批号：152205678，规格：每100m L含奥沙利铂50mg、甘露醇5.1 g）；DMEM培养基和胎牛血清（美国Promega公司）；癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）、鳞状上皮细胞癌相关抗原（SCCAg）试剂盒（瑞士Roche公司）；CD3+、CD4+、CD8+T细胞及NK细胞荧光素标记单克隆抗体（英国Abcam公司）。

1.3 细胞与动物

食管癌Eca109细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。清洁级SD大鼠40只，♂，4～5周龄，体质量160～200 g，购于扬州大学动物实验中心，许可证号：SCXK（苏）2015-0143，在恒温（22～25）、恒湿（40%～60%）条件下饲养，本次研究报请医院动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 细胞培养及移植瘤模型建立

Eca109细胞复苏后采用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，扩增传代后收集对数生长期细胞并调节细胞密度至1×107个/m L。取大鼠，于右侧前肢腋下ih 0.5m L细胞悬液建立移植瘤模型，4 d后肿瘤体积约为100mm3表示建模成功。

2.2 分组与给药

将建模成功的大鼠随机分为模型组、尼美舒利组、奥沙利铂组及联用组，每组10只。尼美舒利组大鼠ig尼美舒利20mg/kg（用羧甲基纤维素钠溶液溶解）；奥沙利铂组大鼠尾iv奥沙利铂13.6mg/kg（用5%的葡萄糖注射液1m L溶解）；联用组大鼠同时ig尼美舒利20mg/kg和尾iv奥沙利铂13.6mg/kg；模型组大鼠同时ig等剂量羧甲基纤维素钠溶液和尾iv 5%的葡萄糖注射液1m L。ig每天1次，尾iv每4 d 1次，连续给药8周。

2.3 肿瘤生长情况观察

给药8周后处死大鼠，测量肿瘤病灶的长径以及与其垂直的短径，计算瘤体积；同时称瘤质量，计算抑瘤率，抑瘤率（%）＝（1－给药组瘤质量/模型组瘤质量）× 100%。

2.4 血清中肿瘤标志物含量测定

给药8周后处死大鼠，摘取眼球取血2m L，1 000×g离心15m in，收集血清置于－80冰箱中保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA），按相应试剂盒说明操作，检测各组大鼠血清中肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、SCCAg的含量。

2.5 外周血中CD3+、CD4+、CD8+T细胞及NK细胞百分比检测

给药8周后处死大鼠，摘取眼球取血2m L，分离外周血单个核细胞，用冰生理盐水清洗，4下300×g离心15m in，弃上清，向沉淀中分别加入5μL CD3+、CD4+、CD8+细胞及NK细胞荧光素标记单克隆抗体，吹打均匀，4孵育60m in。加入细胞洗液，混匀，300×g离心3 min，弃上清，用洗液洗3次；加入破膜液1m L，振荡避光保存12min；加入1m L细胞洗液，300×g离心5min；加入各组对应的抗体20μL，避光孵育30m in；加入1m L细胞洗液，300×g离心5m in，弃去上清。加细胞洗液定容至0.5m L，将沉淀吹打均匀，然后用流式细胞仪测定被标记的CD3+、CD4+、CD8+T细胞及NK细胞的百分比。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 肿瘤生长情况

与模型组比较，其余3组大鼠瘤体积和瘤质量均减小（P＜0.05）。与尼美舒利组比较，奥沙利铂组和联用组大鼠瘤体积和瘤质量均减小（P＜0.05），抑瘤率均增加（P＜0.05）；其中联用组瘤体积、瘤质量减小程度和抑瘤率增加程度均较奥沙利铂组更明显（P＜0.05）。各组大鼠肿瘤的生长情况见表1。

3.2 血清中肿瘤标志物含量

与模型组比较，其余3组大鼠血清中CEA、CYFRA21-1、SCCAg含量均减少（P＜0.05）。与尼美舒利组比较，奥沙利铂组和联用组大鼠血清中CEA、CYFRA21-1、SCCAg含量均减少（P＜0.05），其中联用组减少程度较奥沙利铂组更明显（P＜0.05）。各组大鼠血清中肿瘤标志物的含量见表2。

表1 各组大鼠肿瘤的生长情况（±s，n＝10）Tab 1 Tumor grow th of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各组大鼠肿瘤的生长情况（±s，n＝10）Tab 1 Tumor grow th of rats in each group（±s，n＝10）

注：与模型组比较，＊P＜0.05；与尼美舒利组比较，#P＜0.05；与奥沙利铂组比较，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

组别瘤体积，mm3瘤质量，g 抑瘤率，%

表2 各组大鼠血清中肿瘤标志物的含量（±s，n＝10）Tab 2 Contents of tumor markers in rat serum in each group（±s，n＝10）

表2 各组大鼠血清中肿瘤标志物的含量（±s，n＝10）Tab 2 Contents of tumor markers in rat serum in each group（±s，n＝10）

注：与模型组比较，＊P＜0.05；与尼美舒利组比较，#P＜0.05；与奥沙利铂组比较，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

SCCAg，μg/L 2.29±0.34 1.98±0.26＊1.27±0.19＊#0.52±0.08＊#Δ组别模型组尼美舒利组奥沙利铂组联用组CEA，μg/mL 7.05±0.92 6.30±0.74＊4.42±0.51＊#2.71±0.33＊#ΔCYFRA21-1，ng/mL 5.58±0.89 3.95±0.65＊3.59±0.57＊#2.05±0.36＊#Δ

3.3 外周血中免疫细胞百分比

与模型组比较，尼美舒利组大鼠外周血中CD3+、CD4+T细胞和NK细胞百分比增高，CD8+T细胞百分比降低（P＜0.05）；奥沙利铂组和联用组大鼠外周血中CD3+、CD4+T细胞和NK细胞百分比降低，CD8+T细胞百分比增高（P＜0.05）。与尼美舒利组比较，奥沙利铂组和联用组大鼠外周血中CD3+、CD4+T细胞和NK细胞百分比降低，CD8+T细胞百分比增高（P＜0.05），其中联用组大鼠外周血中免疫细胞百分比介于尼美舒利组和奥沙利铂组中间（P＜0.05）。各组大鼠外周血中免疫细胞的百分比见表3。

表3 各组大鼠外周血中免疫细胞的百分比（±s，n＝10，%%）Tab 3 Percentages of imm une cells in rat peripheral blood in each group（±s，n＝10，%%）

表3 各组大鼠外周血中免疫细胞的百分比（±s，n＝10，%%）Tab 3 Percentages of imm une cells in rat peripheral blood in each group（±s，n＝10，%%）

注：与模型组比较，＊P＜0.05；与尼美舒利组比较，#P＜0.05；与奥沙利铂组比较，ΔP＜0.05Note：vs.modelgroup，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

NK细胞12.54±1.25 15.32±1.36＊7.72±1.05＊#10.68±1.13＊#Δ组别模型组尼美舒利组奥沙利铂组联用组CD3+T细胞45.28±5.94 52.42±6.24＊30.42±4.25＊#40.56±7.12＊#ΔCD4+T细胞25.15±3.14 27.12±3.42＊16.15±1.42＊#21.36±2.68＊#ΔCD8+T细胞30.35±4.52 27.28±3.22＊38.10±4.12＊#34.52±3.35＊#Δ

4 讨论

食管癌是一种总体生存率极低的恶性肿瘤，常采用联合化疗的方式来控制病情的发展[4-5]。铂类药物、伊立替康、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨均被用于此疾病的治疗[6]。近年来对于奥沙利铂治疗食道癌的报道很多[7-8]，因此本研究采取与尼美舒利联用的方案来考察其对食道癌大鼠移植瘤生长及免疫功能的影响，选用尼美舒利作为联合药物旨在降低奥沙利铂的不良反应。

近年来，关于消化道恶性肿瘤的研究证实，COX-2能够通过合成前列腺素来调控癌细胞的生长、分化、侵袭、迁移以及血管新生，进而促进肿瘤病情的发展[9-10]。尼美舒利是新型非甾体类抗炎药物，能够高选择性抑制COX-2的活性，主要成分为2-苯氧基甲基磺酰苯胺，口服后1～2 h能够达到血浆浓度峰值，有效治疗浓度持续时间为6～8 h，相对生物利用度高达95%左右[11]。动物实验证明，尼美舒利能够预防恶性肿瘤的发生，抑制肿瘤的发展、转移与浸润[11]。李佳等[12]的研究认为尼美舒利对胰腺癌PANC-1细胞的生长具有抑制作用，杨凤玉等[13]的研究认为尼美舒利对宫颈癌HeLa细胞的凋亡具有促进作用。本研究发现，联用组大鼠瘤体积和瘤质量均明显低于尼美舒利组、奥沙利铂组（P＜0.05），抑瘤率明显高于尼美舒利组、奥沙利铂组（P＜0.05），提示尼美舒利能增强奥沙利铂对食管癌的抑瘤作用。

肿瘤标志物检测是临床上早期筛查恶性肿瘤以及判断恶性肿瘤病情进展程度的常用方法，与食管癌相关的肿瘤标志物包括CEA、CYFRA21-1、SCCAg[14]。CEA是临床筛查消化道恶性肿瘤最常用的标志物，CYFRA21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，SCCAg是鳞状上皮细胞恶变过程中产生的糖蛋白，3种指标均能反映肿瘤负荷情况[15]。本研究中，联用组大鼠血清中肿瘤标志物含量均明显低于尼美舒利组、奥沙利铂组（P＜0.05），提示尼美舒利能增强奥沙利铂对食管癌的抑瘤作用，治疗后血清中肿瘤标志物含量更低。

化疗药物会造成不同程度的免疫功能损伤，淋巴细胞T细胞亚群与NK细胞均是检验免疫功能的特异性与敏感性标志物[16]。本研究中，联用组大鼠外周血中免疫细胞百分比介于尼美舒利组和奥沙利铂组中间（P＜0.05），提示尼美舒利能降低奥沙利铂治疗后对大鼠免疫功能的抑制程度。

综上所述，尼美舒利与奥沙利铂联用能抑制食管癌模型大鼠的肿瘤生长，其作用机制可能与降低肿瘤标志物含量、改善免疫功能有关，但由于本文只是一个实验性动物研究，缺乏对血管内皮生长因子表达的比较，因此尼美舒利与奥沙利铂联用治疗食管癌的临床疗效还有待于进一步研究。

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（编辑：邹丽娟）

Effects of Nimesulide Combined w ith Oxaliplatin on Transplanted Tumor Grow th and Immune Function of Ratsw ith Esophageal Cancer

LI Meng1，HE Yong2，XIAO Fei1，TIAN Yuanyao1（1.Dept.of Pharmacy，Chaohu Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Anhui Chaohu 238000，China；2.Dept.of Pharmacy，People’s Hospital of Chizhou City，Anhui Chizhou 247000，China）

Esophageal cancer；Nimesulide；Oxaliplatin；Immune function；Rats

relevantmedicines by corresponding ways，once a day for ig，once every 4 d for iv in tail.Rats were sacrificed after 8 weeks，tumor volume and quality of ratsweremeasured，tumor inhibition rate was calculated，and contents of tumormarkers（CEA，CYFRA21-1，SCCAg），percentages of immune cells（CD3+，CD4+，CD8+T cells and NK cell）in peripheral blood were detected.RESULTS：Compared w ith model group，tumor volume and quality in other 3 groups were decreased（P＜0.05）；contents of tumormarkers were decreased（P＜0.05）.Percentages of CD3+，CD4+T cells and NK cell in nimesulide group were increased，percentages of CD8+T cellwas decreased（P＜0.05）.Percentages of CD3+，CD4+T cells and NK cell in oxaliplatin group and combination group were decreased，percentages of CD8+T cell was increased（P＜0.05）.Compared w ith nimesulide group and oxaliplatin group，tumor inhibition rate in combination group was increased（P＜0.05）；contents of tumormarkers were decreased（P＜0.05）；percentages of immune cellswere lower than nimesulide group and higher than oxaliplatin group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Nimesulide can enhance the oxaliplatin’s antitumor effect on esophageal cancer，and decrease its inhibition degree on immune functions.

2016-09-02

2017-04-06）

＊主管药师。研究方向：临床药学。电话：0551-82324114。E-mail：ahlemon@163.com

R965

A

1001-0408（2017）16-2208-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.13

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the effects of nimesulide combined w ith oxaliplatin on transplanted tumor grow th and immune function of ratsw ith esophageal cancer.METHODS：Ratswere random ly divided intomodel group（intragastrically given Sodium carboxymethyl cellulose solution+intravenously given 5%Glucose injection in tail），nimesulide group（intragastrically given 20 mg/kg），oxaliplatin group（intravenously given 13.6 mg/kg in tail）and combination group，10 in each group.Esophageal cancer Eca109 cells were subcutaneously injected to develop transplanted tumormodel.A ftermodeling，rats in each group