超声波辅助提取黑果腺肋花楸黄酮及其抗运动疲劳研究

李瑞芳

（郑州工业应用技术学院，河南郑州450000）

超声波辅助提取黑果腺肋花楸黄酮及其抗运动疲劳研究

李瑞芳

（郑州工业应用技术学院，河南郑州450000）

以黑果腺肋花楸作为原料，采用单因素和响应面试验优化超声波辅助乙醇提取黑果腺肋花楸黄酮工艺，并通过小鼠试验研究黑果腺肋花楸黄酮抗运动疲劳功能。结果表明，超声波辅助提取黄酮最佳参数为超声功率70 W、超声温度61℃、超声时间124 min，此时，黑果腺肋花楸黄酮提取率可达95.64%。影响黑果腺肋花楸黄酮提取率的因素由强到弱为超声温度>超声时间>超声功率。小鼠经灌胃黑果腺肋花楸黄酮后，小鼠力竭游泳时间显著延长且浓度越高效果越明显，血乳酸含量与未灌胃黄酮组小鼠相比显著降低，由此可说明，黑果腺肋花楸黄酮对小鼠具有较强的抗运动疲劳功能。

响应面；超声波；黑果腺肋花楸；黄酮；抗疲劳

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又被称为不老莓，营养价值很高，果实含有大量的多酚、黄酮以及花色苷等成分，具有多重功能[1-2]，有研究表明，其内部含有的多酚在已知植物果实中含量最高，其内部的花青素含量也很高，这些功能成分能够对机体起到降血压、抗氧化以及清除机体的自由基等功效[3-4]；目前黑果腺肋花楸产品较少，开发利用率较低，需要研究其功能成分有利于其产品开发；超声波法是现代较新型的技术之一，具有环保、效率高等优点[5-6]，很多活性成分提取均采用超声波法辅助提取[7-8]，本研究采用超声波法辅助乙醇提取黑果腺肋花楸黄酮，并采用响应面法优化其最佳工艺参数，同时研究黑果腺肋花楸对小鼠的抗运动疲劳功能，可为黑果腺肋花楸功能性产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸：陕西康跃生物科技有限公司；Al（NO3）3、无水乙醇、NaNO2等均为分析纯：淄博市临淄飞硕化工有限公司；芦丁标准品：上海康朗生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1004型电子天平：德州市昊诚实验仪器有限公司；TGL-16G型变频高速离心机：北京鑫润科诺仪器仪表有限公司；AUT-M型超声波发生器：深圳市润正洗净设备有限公司；721G型可见分光光度计：上海金枭电子有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅：南京东迈科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波辅助乙醇提取黑果腺肋花楸黄酮工艺流程

黑果腺肋花楸→洗涤→烘干→粉碎→过筛→超声波辅助乙醇提取→离心分离→过滤→滤液浓缩→干燥→黄酮→待测

1.3.2 黑果腺肋花楸黄酮提取单因素试验

1.3.2.1 超声功率对黄酮提取率的影响

在超声温度60℃、超声时间120 min时，超声功率分别为 50、60、70、80、90 W 时，以黑果腺肋花楸黄酮提取率为考核指标，分析超声功率对黄酮提取率的影响。

1.3.2.2 超声温度对黄酮提取率的影响

在超声功率70 W、超声时间120 min时，超声温度分别为 50、55、60、65、70℃时，以黑果腺肋花楸黄酮提取率为考核指标，分析超声温度对黄酮提取率的影响。

1.3.2.3 超声时间对黄酮提取率的影响

在超声功率70 W、超声温度60℃时，超声时间分别为 80、100、120、140、160 min 时，以黑果腺肋花楸黄酮提取率为考核指标，分析超声时间对黄酮提取率的影响。

1.3.3 黑果腺肋花楸黄酮提取工艺优化

根据单因素结果，以超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C），以黄酮提取率（Y）为指标，设计响应面试验，确定超声波辅助提取黄酮最佳工艺参数。试验设计因素水平见表1。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 芦丁标准曲线的绘制[9-10]

精确称取芦丁标品1 g置于烧杯中，加入乙醇（75%）定容至100 mL，静止20 min后，再从中取5 mL于容量瓶中，再加乙醇定容至100mL，可得到0.5mg/mL芦丁标准溶液；从中分别取 0、1、2、3、4、5、6 mL 溶液于25 mL具塞比色管里，再加入无水乙醇至10 mL，再加5%的NaNO20.8 mL，混匀后静置5min，再加10%的Al（NO3）30.8 mL，混匀后静置5 min，再加NaOH溶液（3%）5 mL，再加乙醇至 25 mL，混匀后静置 20 min，分别于510 nm波长处测吸光度，同时用去离子水做对照。以芦丁质量浓度为X轴、吸光值为Y轴，得回归方程：Y=0.421X＋0.002，R2=0.999 8。

1.3.5 黄酮提取率的测定[11-12]

精确称取5 mL方法1.3.1中制取的浓缩液，同样加到25 mL具塞比色管中，参照1.3.4中试验方法，测溶液吸光值，由回归方程可计算出黄酮含量，再计算黄酮提取率。

1.3.6 小鼠抗疲劳试验

根据试验要求，随机取80只KM雄性小鼠，重量为（22±0.5）g，SPF级，长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（湘）2014-0011，根据体重将小鼠组成4组，每组数量为20只。规定第1组小鼠为对照组、第2、3、4组均灌胃黑果腺肋花楸黄酮，剂量分别为0.1 mL/10 g鼠重、0.2 mL/10 g鼠重、0.3 mL/10 g鼠重，持续灌胃30 d后测小鼠各项指标。

1.3.6.1 小鼠负重游泳实验[13-14]

小鼠经末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，在其尾部负重体重5%的铁丝，使小鼠在标准小鼠试验游泳箱中游泳，游泳箱深度35 cm，水温（25.0±1.0）℃，当小鼠头部浸入水下10 s后无法浮到水面上即为体力耗竭，记下小鼠自游泳开始至体力耗竭的时间，作为小鼠游泳时间。

1.3.6.2 血乳酸含量测定[15]

小鼠经末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，将小鼠置于游泳箱中进行游泳。分别于游泳前、游泳后10 min、游泳10 min休息20 min等3个不同时间段，在小鼠眼眶静脉丛用标准方法进行采血，参照试剂盒法检测小鼠全血乳酸含量。

2 结果与分析

2.1 黑果腺肋花楸黄酮提取单因素试验结果

2.1.1 超声功率对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响

超声功率对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响见图1。

根据图1，当超声功率为50 W时，黑果腺肋花楸黄酮提取率最低，随着超声功率的增大，黄酮提取率逐渐升高，当超声功率达到70 W时，黑果腺肋花楸黄酮提取率最高。继续增大超声功率后，黑果腺肋花楸黄酮提取率几乎不变，原因可能为当超声功率为70 W时已经可满足黄酮的提取，使得黄酮能够充分溶出，故继续增大超声功率提取率几乎不变，因此选择超声功率60、70、80 W为响应面研究水平。

图1 超声功率对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.1.2 超声温度对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响

超声温度对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响见图2。

图2 超声温度对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根据图2，当超声温度为50℃时，黑果腺肋花楸黄酮提取率最低，当超声温度升高后，黑果腺肋花楸黄酮提取率迅速增大，当超声温度达到60℃时，黑果腺肋花楸黄酮提取率达到最高，继续提高超声温度后，黑果腺肋花楸黄酮提取率迅速下降，原因可能是温度过高后使得黄酮损失过多，因此选择超声温度55、60、65℃为响应面研究水平。

2.1.3 超声时间对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响

超声时间对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响见图3。

根据图3，当超声时间为80 min时，黑果腺肋花楸黄酮提取率最低，随着超声时间的延长，黑果腺肋花楸黄酮提取率逐渐升高，当超声时间达到120 min时，黑果腺肋花楸黄酮提取率最高。继续延长超声时间，黑果腺肋花楸黄酮提取率几乎不变，原因可能是当超声一定时间后黄酮已经完全被提出，因此继续延长时间效果不佳，选择超声时间为100、120、140 min为响应面研究水平。

图3 超声时间对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.2 黑果腺肋花楸黄酮提取工艺参数的优化

2.2.1 数学模型的建立与显著性检验

表2 Box-Benhnken中心组合试验设计及结果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

采用Box-Benhnken中心组合试验设计，根据单因素结果，进行三因素三水平的RSM（response surface methodology）分析试验。考察超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）对黑果腺肋花楸黄酮提取率（Y）的影响，试验设计方案及结果见表2。

采用Design-Expert8.0.6软件对表2进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到以黑果腺肋花楸黄酮提取率为目标函数，关于各条件编码值的二次回归方程为：

对该模型进行显著性检验，可得到方差分析见表3，模型的可信度分析见表4。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回归模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the regression model

由表3、4可知，模型的P值小于0.000 1，远小于0.01，说明该模型极显著，回归模型与实际测定数值能够很好的拟合，试验误差较小，因此，可以用该回归方程代替试验真实值对试验结果进行分析，R2=99.19%，预测值与实测值之间具有高度的相关性，说明方程可靠性较高。在回归模型中，B、C、AB、A2、B2、C2，对响应值影响极显著，A、AC，对响应值影响显著。影响产品感官评分由强到弱的因素为超声温度>超声时间>超声功率。

2.2.2 各因素的交互作用对产品感官评分影响

响应面图能够非常直观的表现出两个因素之间的相互作用，也是各因素构成的三维曲面图。通过使一个因素不变，改变另两个因素，将模型降维分析统计，目的是研究各因素间的相互作用对黑果腺肋花楸黄酮提取率的影响。由软件分析可得到响应面图，见图4。

等高线图反应两个因素更直观，在图中椭圆形表示两因素交互作用极显著或者显著，而圆形则表示两因素交互作用不显著。根据方差分析可知，超声功率（A）与超声温度（B）之间的交互作用极显著，具体表现为等高线图呈明显的椭圆形；超声功率（A）与超声时间（C）之间交互作用显著，具体表现为等高线图呈椭圆形。

图4 各两因素交互作用响应面及等高线图Fig.4 Response surfaces and contour plots of the interactive effects of each two factors

2.2.3 优化工艺参数

为进一步确定最佳参数，对拟合的回归方程求分别一阶偏导数，并设其为0，得到三元一次方程如下：

求解得：X1＝0.004、X2＝0.278、X3＝0.222，即最佳工艺参数为超声功率70.04 W、超声温度61.39℃、超声时间124.43 min，在此条件下黑果腺肋花楸黄酮提取率是94.83%。为便于实际操作，将参数修正为超声功率70 W、超声温度61℃、超声时间124 min，采用修正后的工艺参数进行3次平行验证试验，在此条件下黑果腺肋花楸黄酮提取率是95.64%，与理论预测值较为接近，表明数学模型对优化工艺参数是可行的。

2.3 小鼠负重游泳试验结果

小鼠负重游泳试验结果见表5。

表5 小鼠负重游泳试验结果Table 5 Mice weight loading swimming test results

从结果能够明显得出，小鼠经灌胃30 d后，游泳时间显著延长，小鼠经灌胃黑果腺肋花楸黄酮浓度越高，小鼠平均游泳时间越长，因此，可说明黑果腺肋花楸黄酮具有抗疲劳功能。

2.4 血乳酸测定结果

小鼠血乳酸测定结果见表6。

表6 黑果腺肋花楸黄酮对游泳前后小鼠血乳酸值的影响Table 6 Effect of the Aronia melanocarpa flavonoids to swim around the mouse blood lactate values

由表6可见，小鼠灌胃黑果腺肋花楸黄酮30 d后，在游泳前安静状态时，黑果腺肋花楸黄酮对小鼠体内血乳酸含量无显著性影响。游泳后10 min，每组小鼠血乳酸含量比游泳前有明显提高。但和对照组相比，黑果腺肋花楸黄酮能显著降低运动小鼠血乳酸含量，并且灌胃剂量越大，下降越明显。游泳10 min休息20 min，再测血乳酸含量，不同剂量的黑果腺肋花楸黄酮均能显著降低小鼠血乳酸含量。说明黑果腺肋花楸黄酮具有抗疲劳功能。

3 结论

超声波辅助乙醇提取黑果腺肋花楸黄酮最佳工艺参数为超声功率70 W、超声温度61℃、超声时间124 min，在此条件下，黑果腺肋花楸黄酮提取率可达到95.64%。影响黑果腺肋花楸黄酮提取率因素由大到小依次为超声温度>超声时间>超声功率。小鼠经灌胃30 d后，游泳时间显著延长，灌胃黑果腺肋花楸黄酮浓度越高，小鼠平均游泳时间越长。试验组和对照组比较，黑果腺肋花楸黄酮能显著降低运动小鼠血乳酸含量，并且灌胃剂量越大，下降越明显，不同剂量的黑果腺肋花楸黄酮均能显著降低小鼠血乳酸含量。由此可说明黑果腺肋花楸黄酮具有抗运动疲劳功能，可为运动员开发保健抗疲劳食品提供参考。

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Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Aronia melanocarpa and Its Anti-exercise Fatigue

LI Rui-fang
（Zhengzhou University of Industry Technology，Zhengzhou 450000，Henan，China）

The single factor and response surface method was used to optimize the ultrasonic extraction of flavonoids from Aronia melanocarpa.The anti-fatigue effect of the flavonoids of Aronia melanocarpa was studied by mouse experiment.The results showed that the optimal extraction parameters was ultrasound power 70 W，ultrasonic temperature 61℃，and ultrasonic time 124 min.The extraction rate of flavonoids was 95.64%.The factors influencing the extraction rate of flavonoids from Aronia melanocarpa was ultrasonic temperature>ultrasonic time>ultrasonic power from strong to weak.After mice fed with flavonoids，the exhaustive swimming time of the mice was significantly prolonged and the higher the concentration the more obvious，the blood lactic acid content was compared with that of the non-perfused flavonoids group.Flavonoids of Aronia melanocarpa on mice had strong anti-exercise fatigue function.

response surface；ultrasound；Aronia melanocarpa；flavonoids；anti-fatigue

2017-01-20

李瑞芳（1984—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：体育运动保健。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.014