大黄素对裸鼠人结肠癌细胞移植瘤的抑制作用及机制

金剑，赵庆

(上海市第一人民医院宝山分院，上海 200000)

大黄素对裸鼠人结肠癌细胞移植瘤的抑制作用及机制

金剑，赵庆

(上海市第一人民医院宝山分院，上海 200000)

目的 探讨大黄素对裸鼠人结肠癌细胞移植瘤生长及血管生成的抑制作用及其机制。方法 建立裸鼠人结肠癌细胞SW480移植瘤模型，随机分为大黄素低、中、高剂量组和对照组，每组10只。大黄素低、中、高剂量组分别予浓度为10、20、40 mmol/L的大黄素(5 mL)灌胃，对照组予等量生理盐水灌胃，均1次/d。灌胃3周脱臼处死，剥取肿瘤并测量其体积及质量，计算抑瘤率；免疫组化法检测瘤组织微血管密度(MVD)和β-catenin表达；ELISA法测定血清内皮生长因子(VEGF)、血管生成素2(Ang-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平。结果 抑瘤率：大黄素低、中、高剂量组分别为29.32%、36.08%、41.62%；MVD计数：对照组、大黄素低、中、高剂量组分别为(48.21±1.89)、(43.09±1.78)、(27.45±2.24)和(21.31±1.85)个，两两比较P均<0.01。大黄素低、中、高剂量组血清VEGF、Ang-2、bFGF水平及瘤组织β-catenin蛋白表达均明显低于对照组(P均<0.01)，且呈剂量依赖性。结论 大黄素可抑制裸鼠人结肠癌移植瘤的生长及微血管形成，其机制可能为下调Wnt/β-catenin通路中的促血管生成因子表达。

结肠癌；移植瘤；大黄素；Wnt/β-catenin；促血管生成因子；微血管密度；裸鼠

肿瘤向周围脏器组织侵袭和转移依赖于血管新生[1,2]。根据结肠癌病理特征及血管形成的分子机制，破坏结肠癌供血血管或阻断新生血管形成是结肠癌治疗的重要途径[3]。研究报道，肠道肿瘤形成过程中血管内皮生长因子(VEGF)水平被Wnt/β-catenin通路中的转录因子上调，该作用方式在结肠癌中或许同样存在。作为蒽醌类物质的大黄素，已在肿瘤细胞及动物模型中表现出抗增殖和抗转移的作用[4,5]。大黄素对宫颈癌、肝癌细胞等具有杀伤和抑制生长的作用，效果非常明显[6,7]。但大黄素能否抑制结肠癌细胞血管生成及其其作用机制，相关报道较少。2015年10月～2016年8月，本研究探讨了大黄素对人结肠癌移植瘤生长及血管生成的抑制作用及机制，旨在为大黄素治疗结肠癌提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人结肠癌细胞SW480购自上海中科院细胞库，在含1.5 mmol/L谷氨酰胺的培养液，5%的FBS，5% CO2、37 ℃培养箱中培养。动物：BALB/c裸鼠40只，雄性，SPF级，体质量18～22 g，购自同济医院动物中心。药物：大黄素(纯度≥99.0%)购自中国食品药品检定研究院；0.5 mg大黄素溶于100 μL DMSO，并按顺序加3.7 mL灭菌水、25 μL 5 mmol/L NaOH溶液；过滤溶液作为母液，-20 ℃冻存；临用前无菌水稀释。血管生成素2(Ang-2)、VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)试剂盒购自上海博谷生物科技公司。仪器：Galaxy S培养箱(RS)；5804R高速冷冻离心机(Eppendorf)。

1.2 移植瘤模型建立及分组干预 取对数生长期人结肠癌细胞SW480，调整细胞密度为1×107个/mL，200 μL/只接种裸鼠背部近右上肢皮肤。1周后，瘤体直径约1 cm。取肿瘤组织切成1 mm3，小鼠右侧颈背部皮下皮下注射。细胞进行3次传代，继续接种，直至裸鼠移植瘤模型建立。约1周，游标卡尺测量移植瘤的直径，待肿瘤体积200 mm3左右时，随机分为对照组、大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组，每组10只。大黄素低、中、高剂量组分别给予浓度为10、20、40 mmol/L的大黄素(5 mL)灌胃；对照组予等体积生理盐水灌胃，1次/d。

1.3 相关指标观察 各组灌胃3周从眼球取血并取出瘤体，行以下指标观察。

1.3.1 血清VEGF、Ang-2和bFGF水平 裸鼠经眼球取血并分离血清，采用ELISA法测定血清Ang-2、VEGF和bFGF水平。

1.3.2 抑瘤率 记录肿瘤体积并称重。抑瘤率(%)=(1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值)×100%。

1.3.3 肿瘤微血管密度(MVD) 采用免疫组化法。肿瘤组织经甲醛固定后依次经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，抗原修复，封闭，孵育，DAB显色，终止反应；复染，脱水，透明，树脂封片操作。阳性对照是已知的阳性切片，阴性对照采用PBS代替一抗进行。瘤体组织切片在100倍下光镜扫描，选择微血管标记区密集区域，200倍下光镜扫描选取5个不重复视野计数，均值作为标本MVD值。定位于血管内皮细胞的CD34阳性染色呈棕褐色，黏膜组织中棕褐色单独的内皮细胞及簇均计为一个血管，排除肌层厚及管腔红细胞数大于8个的血管。

1.3.4 肿瘤组织β-catenin表达 采用免疫组化法。阳性片及PBS代替一抗片分别作为阳性、阴性对照。细胞质、细胞核和细胞膜是β-catenin表达聚集的地方，染色呈棕黄色颗粒，细胞中出现棕黄色颗粒状物判定阳性。于200倍光镜扫描下任选切片10个视野(细胞数>1 000)，采用双盲法计数阳性细胞。阳性率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 各组血清Ang-2、VEGF和bFGF水平比较 与对照组比较，大黄素低、中、高剂量组血清VEGF、Ang-2、bFGF水平均明显下调(P均<0.01)，且具有剂量依赖性。见表1。

表1 各组血清Ang-2、VEGF和bFGF相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与大黄素低剂量组比较，△P<0.01。

2.2 各组抑瘤率比较 对照组及大黄素低、中、高剂量组肿瘤体积分别为(501.0±41.7)、(362.0±50.2)、(315.2±80.3)、(292.0±40.8)mm3，瘤重分别为(0.524±0.026)、(0.354±0.089)、(0.323±0.096)、(0.293±0.041)g，两两比较P均<0.01；大黄素低、中、高剂量组抑瘤率分别为29.32%、36.08%、41.62%；见插页Ⅲ图3。

2.3 各组肿瘤MVD比较 对照组及大黄素低、中、高剂量组瘤体MVD计数分别为(48.21±1.89)、(43.09±1.78)、(27.45±2.24)和(21.31±1.85)个，两两比较P均<0.01。见插页Ⅲ图4。

2.4 各组瘤体β-catenin蛋白表达比较 对照组和大黄素低、中、高剂量组β-catenin蛋白相对表达量分别为1.00±0.08、0.63±0.05、0.58±0.02、0.46±0.02。与对照组比较，大黄素低、中、高剂量组均明显下调，且呈剂量依赖性(P均<0.01)。

3 讨论

实体肿瘤快速生长、转移的决定性因素是新生血管形成。抑制血管生成，切断肿瘤生长的供养途径使肿瘤的血行通道得以阻断，可有效遏制肿瘤的生长和扩散[8,9]。抑制血管生成因子或抑制促血管生成因子均能抑制血管生成[10]。

中药或其有效成分能够抑制血管新生，起到抗肿瘤效果，如丹参酮ⅡA等。有研究表明，大黄素能够抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡[11,12]。本研究发现，与对照组比较，大黄素低、中、高剂量组瘤体较小，瘤重更轻，且呈剂量依赖性；大黄素低、中、高剂量组瘤重抑制率分别为29.32%、36.08%、41.62%，但与5-FU组比较差异无统计学意义。研究表明，大黄素能够抑制肿瘤MVD形成以及下调促血管生成因子Ang-2、VEGF和bFGF表达。本研究结果发现，大黄素低、中、高剂量组与对照组相比，MVD均明显降低，浓度越大下降越明显，高剂量组MVD不足对照组的50%。大黄素抑制裸鼠人结肠癌微血管的形成作用效果显著。与对照组比较，裸鼠血清中VEGF水平在大黄素低、中、高剂量组均下调，分别是对照组的0.71、0.56和0.42倍，具有剂量依赖性。血清中Ang-2水平在大黄素低、中、高剂量组同样下调，分别是对照组的0.70、0.65和0.46倍；血清中bFGF表达水平在大黄素低、中、高剂量组均呈降低趋势，分别为对照组的0.80、0.73和0.65倍。可以看出，大黄素对VEGF下调能力最强，其次Ang-2，再次bFGF。结果表明大黄素明显抑制裸鼠人结肠癌促血管生成因子VEGF、Ang-2和bFGF表达，但调控能力有差异。

血管生成抑制因子Arresten可通过抑制内皮细胞增殖和凋亡进而抑制肿瘤血管生成[13～15]。有研究发现，转染pSecTag2-arrestenLOVO后肿瘤结节形成数和MVD低于对照组[16,17]；人Ⅳ型胶原肿瘤血管生成抑制因子具有类似功能[18,19]。Rao等[20]检测结肠癌患者VEGF和β-catenin表达，发现两者有正相关性。β-catenin的结合位点在VEGF启动子区，转染β-catenin后，VEGF的mRNA和蛋白表达上调。本研究移植瘤组织β-catenin表达下调，与MVD和VEGF等分子的变化趋势相关；与Zhang等[21]、Huang等[22]研究结果吻合。

综上所述，大黄素可抑制裸鼠人结肠癌移植瘤生长及MVD形成。其作用机制可能为调控Wnt/β-catenin通路中的关键分子，下调促血管生成因子VEGF等表达。

[1]RasoolS,KadlaSA,RasoolV,etal.AcomparativeoverviewofgeneralriskfactorsassociatedwiththeincidenceofColorectalcancer[J].TumourBiol, 2013,34(5):2469-476.

[2]AhnenDJ,WadeSW,JonesWF,etal.Theincreasingincidenceofyoung-onsetcolorectalcancer：acalltoaction[J].MayoClinProc, 2014,89(2):216-224.

[3]PriyadarsiniRV,NaginiS.Cancerchemopreventionbydietaryphytochemicals：promisesandpitfalls[J].CurrPharmBioteehnol, 2012,13(1):125-136.

[4]AhmedinJD,FreddieBray,MelissaM,etal.GlobalCancerStatistics[J].CACancerJClin, 2011,61(2):69-90.

[5] 刘宁宁,王炎,周利红,等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌血管新生的抑制研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(1): 88-92,95.

[6] 刘静,史勤,吕祥,等.健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠COX-2,NF-kb和AP-1表达的影响[J].中华中医药杂志,2012,27(7):1932-1934.

[7] 金旻逸,丁越,张彤,等.肠胃清颗粒提取工艺研究[J].亚太传统医药,2011,7(2):20-23.

[8] 王俞,崔书中.恶性肿瘤患者的免疫功能状态及免疫治疗研究进展[J].中国肿瘤临床,2014,41(13):876-879.

[9] 刘宣,李丹光,周利红,等.PGE2/COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路调控人肠癌细胞VEGF表达[J].第二军医大学学报,2012,33(11):1178-1181.

[10] 刘宣,王炎,殷佩浩,等.Wnt/β-catenin信号通路对人肠癌细胞VEGF表达的调控作用[J].中国癌症杂志,2012,22(12):881-885.

[11] 刘宁宁,周利红,殷佩浩,等.健脾解毒方对幽门螺杆菌诱发胃癌过程微血管密度及环氧合酶表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2011,31(5):647-652.

[12] 刘宣,王炎,李丹光,等.丹参酮ⅡA对COX-2激活β-catenin信号通路介导的人肠癌细胞VEGF表达的调控作用[J].中华中医药杂志, 2013,28(1):108-112.

[13] 谢丹,林源,杨阿莉.大黄素抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长机制探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2015,22(1):28-33.

[14] 钱晓萍,刘宝瑞,胡静,等.汉防己甲素抑制血管生成的作用[J].癌症,2008,27(10):1050-1055.

[15] 凌彬,陈曼丽,刘洁,等.普萘洛尔治疗增殖期血管瘤患者血管内皮生长因子-A及表皮生长因子样结构域7的表达分析[J].华西口腔医学杂志,2014,32(5):441-445.

[16] 李杰玉,陈泽奇,林源,等.大黄素对人肝癌HepG2细胞AIF和EndoG蛋白表达的影响[J].现代生物医学进展,2009,9(5):829-831.

[17] 凌彬,陈曼丽,刘洁,等.普萘洛尔治疗增殖期血管瘤患者血管内皮生长因子-A及表皮生长因子样结构域7的表达分析[J].华西口腔医学杂志,2014,32(5):441-445.

[18] 洪亚琼,金慧实,鄢鸿,等.低剂量辐射联合阿霉素对荷乳腺癌裸鼠移植瘤生长及其移植瘤组织中HIF-1α和VEGF表达的影响[J].吉林大学学报：医学版,2015,41(1):43-46.

[19] 谢丹,林源,杨阿莉.大黄素抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长机制探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2015,22(1):28-33.

[20]RaoC,LinSL,WenH,etal.CrosstalkbetweencanonicalTGF-β/SmadandWnt/β-cateninsignalingpathway[J].ZhejiangDaXueXueBaoYiXueBan, 2013,42(5)：591-596.

[21]ZhangL,KimS,DingW,etal.Arsenicsulfideinhibitscellmigrationandinvasionofgastriccancerinvitroandinvivo[J].DrugDesDevelTher, 2015(9):5579-5590.

[22]HuangD,DuX.CrosstalkbetweentumorcellsandmicroenvironmentviaWntpathwayincolorectalcancerdissemination[J].WorldJGastroenterol, 2008,14(12):1823-1827.

上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20144Y01116)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.011

R735.3

A

1002-266X(2017)20-0037-03

2016-10-07)