番茄斑萎病毒检测技术研究进展

覃茜　张艳明　韦勇杰　罗清　谢振兴　於艳萍

摘 要：番茄斑萎病毒能侵染多种作物产生严重病害，对其进行鉴定和检测尤为重要。文章从电子显微技术、血清学技术以及分子生物学技术等三种检测技术对番茄斑萎病毒的鉴定及检测进行了综述，总结出番茄斑萎病毒检测技术目前存在检测成本高，试剂毒性大等问题，同时，病毒无法进行离体培养，限制了研究工作的进一步开展。最后展望了多种检测技术在病毒检测中的应用。

关键词：番茄斑萎病毒 检测技术 研究进展

番茄斑萎病毒病的病原为番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV），该病毒属于布尼亚病毒科（Bnuyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus），主要通过蓟马传播危害植物，侵染后发病的症状多为严重的坏疽，或致使寄主细胞质壁分离[1-2]。1919年该病害首次报道于澳大利亚，19世纪80、90年代曾暴发流行于美国夏威夷、意大利，危害番茄、莴笋等作物，造成毁灭性灾害，20世纪90年代末，该病迅速在日本各地传播，现广泛流行世界各地。目前，番茄斑萎病毒病因其对多种作物均能造成严重的危害并造成重大经济损失而被列为世界十大农业病害之一，在国际上备受重视[3-4]。

Tospovirus的病毒粒子为球形，直径80～110 nm，外层包被一层脂质，脂质由G1和G2两种多糖蛋白组成，基因组由3个片段（LRNA，MRNA和SRNA）组成，属于负单链RNA （-ssRNA类型）[5]。随着分子生物学的迅猛发展，Tospovirus由最初确定的一个种（TSWV）增加到目前的19个种，其中确定种14个，暂定种5个。Tospovirus寄主广泛，可侵染84个科1090种植物[6]。再加上该病毒种类繁多、侵染植株症状不一，故对其进行鉴定和检测显得尤为重要。本文就近年来电子显微技术、血清学技术以及分子生物学技术等检测方法在TSWV病毒鉴定检测中的应用进行了综述。

1 电子显微技术

电子显微技术是病毒检测的常用手段，可用于病毒的形态结构及其寄主的细胞超微结构变化的观察。自Kausche等1939年首次在电镜下观察到烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）以来，电子显微技术就成为植物病毒研究不可或缺的常规手段之一[7]。寄主植物被TSWV侵染后，体内会出现典型的球状并具包膜的植物病毒粒体，细胞质内有包含体聚集，可通过电镜观察感病植株组织来鉴定，这在电子显微鉴定上有十分重要的意义[8-10]。

1.1 负染色法（Negative stain）

负染色法以快速简便著称，它可直接观察病毒粒体的大小、形态结构、有无包膜等[11]。TSWV的病毒粒子聚集于延伸的内质网池中，内含体作为其诊断的依据[12]。经电镜负染色法观察TSWV，可见该病毒粒体直径为80～110 nm，球形，一般有1层厚度约5 nm的外膜，外膜的厚度各不相同，有的外膜消失，仅见核壳体[10]。

1.2 超薄切片法（Ultrathin Sectioning）

当病毒侵染植物后，植物细胞会产生具有一定分布特点的特征性内含体，利用超薄切片法鉴定观察，可诊断鉴定病毒病原和细胞病理。王健华等[7]通过对被TSWV侵染的云南烤烟进行超薄切片制样和染色后观察发现受侵染细胞内的亚细胞结构随着侵染时间的增长受破坏程度增大。早期，负染和超薄切片电镜还有被用于不同株系的巨细胞病毒（Cytomegaoviyns，CMV）的区分和马铃薯Y病毒属的9个病毒种的鉴别等[13-14]。

1.3 免疫电镜（Immunosorbent Electron Microscop

y，IEM）

1973年，Derrick K S将免疫学技术结合到电镜技术当中，发明出免疫吸附电镜技术，该技术较电镜技术更为灵敏，现已成为植物病毒研究的一个重要技术[15]。后来， Louro D等人在此基础上发明了悬浮样品的胶体金标记免疫修饰法[16]。免疫电镜的出现为番茄斑萎病毒属的鉴定提供了便利条件[8]。

2 血清学技术

检测植物病毒最为常用和有效的手段之一是血清学技术。由于不同病毒产生的抗血清各不相同，因此可以用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类[17]。

2.1 免疫胶体金技术（Immune Colloidal Gold Technique，GICT）

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物的一种新型免疫标记技术，它应用于抗原抗体。1983年，该技术首次用于检测植物病毒。之后做了改进，使检测更为快速简易。在TSWV检测上，美国Agdia公司发明并推广应用了TSWV试纸，给TSWV等的检测提供了便利[18]。

2.2 酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）

酶聯免疫吸附法（ELISA） 是目前应用最广泛的血清学检测法。自1977年Clark等人发明了检测植物病毒的ELISA法[19]，它便在植物病毒检测中被广泛应用。ELISA测定的基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合，具有所需材料少、操作简单方便、且多种病毒可同时测定的特点，已得到广泛的推广和应用。2013年，刘陈晨等利用ELISA检测重庆烟草上的番茄斑萎病毒[20]。

2.3 双抗体夹心法（Double Antibody Sandwich，DAS-ELISA）

双抗体夹心法建立于ELISA的技术基础上，具有更高的灵敏性和更强的专化性。近年来，此方法被多次应用于TSWV的检测，如冯黎霞等通过此方法，快速地从美国进境的生菜种子中筛选出携带有TSWV的样品[21]。

2.4 三抗酶联反应吸附测定法（Triple Antibody Sandwich ELISA，TAS-ELISA）

早在70年代，就有先人成功应用三抗酶联免疫吸附测定法TAS-ELISA检测病毒的例子。蓟马个体小，常规方法很难检测单个蓟马体内所携带的病毒，但是Roggero等却应用TAS-ELISA成功地检测到西花蓟马（Frankliniella occidentalis）上的TSWV病毒[22]。

2.5 组织印迹法（Tissue blot-ELISA）

组织印迹法（Tissue blot-ELISA）是在ELISA的基础上发展起来的检测技术，该方法进行特异性反应前，先将待检样品在硝酸纤维膜上进行印迹。Whitfield等采用此方法成功检测到凤仙花（Impatiens balsamina）等受侵染观赏植物中的 TSWV[23]。组织印迹法特别适用于大规模的植物病毒检测。

3 分子生物学技术

目前病毒检测最常用的手段是分子生物学检测技术。该技术的优点是快速检测、重复性好，缺点是对核酸质量要求高，仪器设备昂贵等。但是，该检测技术也在不断地更新发展，衍生出一系列的RT-PCR技术、核酸分子杂交技术等。

3.1 逆轉录PCR（Reverse transcription-PCR，

RT-PCR）

RT-PCR技术的优点是特异强、快速简便、灵敏等，它是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。RT-PCR技术已在90年代就被成功应用于TSWV检测，后来Cortezi等对该技术做了改进，使检测更灵敏、可靠[24]。冯黎霞等人对通过DAS-ELISA筛选出携带TSWV的生菜种子后进行RT-PCR 检测，成功的检测到TSWV[21]。2017年，李洁等人首次利用同样的技术对山东地区的TSWV进行了证实[25]。

3.2 多重RT-PCR技术（Multiple RT-PCR）

多重RT-PCR技术是在RT-PCR技术上建立起来的一种检测方法，它可以将待测病毒的多对特异性引物反应加在同一反应体系中。此方法特别适用于同时检测复合侵染的多种病毒。杨英华等建立了可同时检测包含TSWV在内的多种病毒的多重RT-PCR方法，大大节省了检测时间和试剂[26]。代欢欢等利用同样的方法，将受侵染寄主植物中的TSWV、INSV和IYSV快速、同步、特异地检测出来[27]。

3.3 逆转录环介导等温扩增技术（Reverse transcription-Loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP技术是在等温条件下进行核酸扩增的。与常规RT-PCR相比，RT-LAMP技术具有特异性强，检测时间短等优点。2004年，Matsuura等利用高灵敏度的IC/RT-LAMP技术检测出TSWV[28]。

3.4 免疫捕捉RT-PCR（Immunocapture reverse

transcription PCR，IC-RT-PCR）

免疫捕捉RT-PCR技术是RT-PCR与ELISA相结合的一项新兴检测技术。该技术利用病毒专化性抗体与病毒抗原相结合，在进行RT-PCR扩增反应前将目标病毒在微管或微板等固相上固定好，经洗脱处理—富集病毒—RT-PCR反应，这种操作过程不需要提取核酸[17]。于翠等人提出以TSWV作为抗原，利用IC-RT-PCR技术运用到检测中，可检测到TSWV[29]。

3.5 实时荧光PCR技术（Real-time fluorescent

PCR）

实时荧光PCR技术结合了RT-PCR和荧光的优点，利用Taq聚合酶的5-端核酸酶活性来切割一个荧光探针，该荧光探针是不能延伸、双标记的、并且是在扩增过程中与目标序列退火的[30]。实时RT-PCR技术具有快速灵敏，效率高，可实时检测，并无需琼脂糖电泳和EB染色，在一个反应管内可自动完成，大大减少污染，易定量等优点[31]。与步骤繁琐且实验过程存在安全隐患的常规PCR等技术检测番茄斑萎病毒相比较，实时荧光PCR技术不仅可以避免实验中存在的安全隐患，还缩短了检测时间，并提高了灵敏度和准确度。因此，目前学者们认为实时荧光PCR技术是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方式，它将成为植物病害诊断的标准方法。利用该技术可以检测在被侵染植物和个体蓟马上的TSWV。2000年，Boonham等也利用此方法，检测西花蓟马上的TSWV [32]。

3.6 核酸分子杂交技术（Technique of nucleic acid hybridization）

利用病毒基因组序列配对杂交显示信号检测病毒的方法叫做核酸分子杂交技术。该技术可根据需要制备单特异性探针，也能制备检测多种病毒的复合型探针。Aparicio[33]和Serena等[34]分别利用多价复合探针和一个DNA探针成功检测出包括TSWV在内的多种病毒。多价探针的应用，有利于节省检测时间和成本。

3.7 核酸序列依赖性扩增技术（Nuleic and sequece based amplipicain，NASBA）

作为在PCR技术基础上发展起来的一种新扩增技术，NASBA具有特异性好、灵敏度高、快速、高通量等优点，适用于检测实际样品。该技术在1990年被Guatelli首次提出 [35]。2016年，吴兴海等人利用NASBA技术成功检测出TSWV，建立了可快速检测TSWV的NASBA技术[36]。

4 问题与展望

番茄斑萎病毒能侵染多种植物产生病害，对农业生产影响极大，国内外十分重视对该病毒的检测。番茄斑萎病毒的检测技术也随着科学的进步而不断的发展着。目前，该病毒的检测技术在不断地提高，经过反复研究及改进，使其检测技术更简便，检测时间和成本也逐渐减少，而检测的灵敏度和精确度也在不断地提高。虽然，番茄斑萎病毒的检测技术在不断进步，但是，目前番茄斑萎病毒的检测技术仍存在一些问题：一是检测所需药品、仪器价格昂贵；二是检测所需药品毒性大，不利于研究；三是病毒本身不能离体培养，这就给研究带来了很大阻力。

病毒的检测是研究的基础，要在研究及防治番茄斑萎病毒引起的植物病害获得突破，就要从病毒检测入手。虽然植物病毒檢测比较困难，但是随着分子生物学技术发展，植物病毒检测技术取得了很大的进展。利用以上各种方法检测植物病毒各有优劣，实验中应该结合实际，合理选择检测方法，才能更顺利的开展实验。多种检测技术联合应用，是综合优化各种技术手段的最佳选择番茄斑萎病毒的检测在不断进步着，相信控制该病的发生指日可待。

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