压力超负荷致心肌肥厚形成过程中收缩压和心重指数的变化

梁悦+张光涛+汤晓萌+王迎春+刘玉琴+史君

[摘要] 目的 探讨从心血管压力负荷增加到心肌肥厚形成的全过程中收缩压和心重指数的变化。 方法 选用健康雄性Wistar大鼠80只，随机分为假手术组与腹主动脉缩窄组，每组各40只。两组大鼠分别随机分配到4个时间点（术后3 d、1周、2周和4周），各10只。参照腹主动脉缩窄术制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型，大鼠收缩压采用无创尾动脉血压测定分析系统进行测量，电子天平称量左心室重和体重，随后计算心重指数（LVW/BW）。 结果 与假手术组相比较，腹主动脉缩窄组术后3 d时，即表现出收缩压升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；在术后1周，收缩压继续升高，心重指数开始增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后2、4周，收缩压和心重指数继续增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 大鼠造模1周时开始出现心肌肥厚，模型在4周时比较稳定，利用腹主动脉缩窄术制作压力超负荷心肌肥厚大鼠模型成功。

[关键词] 心肌肥厚；腹主动脉缩窄术；收缩压；心重指数

[中图分类号] R542.2；R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0016-04

[Abstract] Objective To discuss the change of systolic pressure and heart weight index （HWI） in the process of cardiovascular pressure overload to myocardial hypertrophy. Methods 80 healthy male Wistar rats were randomly divided into two groups， sham operation group and abdominal aorta group. Each group was randomly separated to 4 time points （3 d， 1 week， 2 weeks， 4 weeks after surgery）. Hypertrophy rats model was made by transverse aortic constriction （TAC）， systolic blood pressure was measured by noninvasive tail arterial blood pressure measurement and analysis system. The weight of the left ventricular and body was measured by an electronic balance， and the HWI was then calculated. Results Compared with sham operation group， 3 d after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， the difference was statistically significant （P < 0.05）； 1 week after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， HWI increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）； 2， 4 weeks after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， HWI increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Rat myocardial hypertrophy model is formed gradually after 1 week and the model is stable in the fourth week. By abdominal TAC， the pressure overload was successfully produced and the myocardial hypertrophy can be induced successfully.

[Key words] Hypertrophy； Transverser aortic constriction； Systolic pressure； Heart heavy index

心肌肥厚是心臟组织负荷异常增加的一种代偿反应，以心肌细胞的体积增大、蛋白质的合成增加以及细胞间质改变为主要特征，是引起心血管疾病病死率显著升高的危险因素之一。近年来，不同学者对心肌肥厚的发生与发展机制一直进行着深入研究，制作合适稳定的心肌肥厚模型是进行实验研究的基础。实验研究证实[1]，导致心肌肥厚发生发展的重要因素之一是压力超负荷。炎症及心肌损伤等因素可以通过一些分子和细胞机制引起心肌肥厚[2]。除此，一些神经体液因素，例如血管紧张素Ⅱ、去甲肾上腺素、β型转化生长因子（TGF-β）等也参与调节心肌肥厚的发生发展[3-8]。新近研究[9-10]发现microRNAs（miRNAs）参与心脏的病理生理过程，并且发挥着重要作用。miRNAs是一类非编码、内源性的小RNA，在基因的转录和表达调控等诸多方面起重要作用，可能促进心肌细胞增生异常，参与心脏重塑进程及心肌肥厚。本文参照文献[9]制作大鼠压力超负荷致心肌肥厚模型，观察压力负荷异常增加致心肌肥厚形成的全过程中血压和心重指数的变化，从而对该模型制备方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄Wistar大鼠80只，体重约180 g，全部为雄性。由维通利华（北京）实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012-0001。大鼠饲养在SPF级动物房，室温22～24℃，相对湿度50%～60%，动物房光照时间为8：00～20：00。按国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食饮水。将大鼠随机分为假手术组和腹主动脉缩窄组，每组各40只。大鼠分别随机分配到4个时间点（术后3 d、1周、2周和4周），每个时间点各10只。

1.2 动物模型制备

参照文献[9]方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型。术前禁食水10 h后，用2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，右侧卧位，在左侧肋缘下腰大肌外缘术野剪毛备皮，3%碘酒消毒，用75%乙醇脱碘，铺无菌洞巾。沿左侧肋缘下作一个长约2 cm的斜形切口，依次分离腹膜后软组织及脂肪组织，于肾动脉上方游离一小段腹主动脉，穿过一消毒4号手术缝线，将去尖的7号针头连同腹主动脉一起结扎，然后立即抽出针头，造成腹主动脉狭窄，逐层撒入少量青霉素粉，逐层缝合切口。假手术组在分离一小段腹主动脉后，只穿过一消毒手术缝线，但不作结扎。其余手术步骤同上。

1.3 观测指标

1.3.1 动脉收缩压（SBP） 置大鼠于固定器内，鼠尾暴露至尾根部，烤灯下加热10 min，充分扩张鼠尾动脉后，在鼠尾根部固定加压尾套，将脉搏传感器与大鼠尾部腹面正中部紧密接触（无创尾动脉血压测定分析仪，Powerlab ML125/R澳大利亚埃德仪器有限公司生产），查看脉搏波形，当稳定的脉搏波出现时，开始测量血压。大鼠安靜时，尾套内打气加压（选择90～420 BPM），加压致脉搏波减小至消失时，开始减压放气，当鼠套内压力=收缩压时，出现脉搏波，此刻血压值等于动脉收缩压。动脉收缩压取重复测量3次的平均值，单位为kPa。测量时间点：假手术组和腹主动脉缩窄组大鼠术后3 d，1、2、4周。

1.3.2 心重指数（LVW/BW） 用2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，采用电子天平上称量并记录体重（BW），称重后断头处死，将完整心脏取出，4℃预冷生理盐水冲洗心脏，清洁滤纸吸干水分，剔除左右心房及右心室，保存左心室与室间隔并置于电子天平上称重，计算出LVW/BW（mg/g）。测量时间点：假手术组和腹主动脉缩窄组大鼠术后3 d，1、2、4周。

1.3.3 制作HE染色切片 取左心室垂直于长轴切取厚约3 mm心肌组织放入10%的福尔马林固定，石蜡包埋，制作HE染色的常规切片。具体步骤如下：将采用切片机切好的切片恢复至室温；两个二甲苯缸各反应10 min；梯度酒精下行（100%Ⅱ～100%Ⅰ～95%～90%～80%～70%），各反应5 min，自来水冲洗3次；苏木精染色3 min，自来水冲洗；盐酸酒精数秒，自来水反蓝15 min；伊红染色30 min，自来水冲洗浮色；梯度酒精（上行）各反应数秒；二甲苯上行各反应5 min；中性树胶封片上镜观察。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 23.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌形态学观察

假手术组大鼠心肌细胞排列较齐整，细胞核为卵圆形，居中位置。手术1周后，心肌细胞排列紊乱、肿胀，出现少量间质增生，部分细胞的细胞核消失；腹主动脉部分缩窄2周后心肌细胞排列拥挤，间质大量增生；4周后心肌纤维化明显。见图1～4。

2.2 SBP和LVW/BW的变化

手术后不同时间点两组大鼠血压和心重指数的变化，与假手术组相比较，腹主动脉部分缩窄3 d后SBP升高，差异有统计学意义（P < 0.05），LVW/BW无明显的变化（P > 0.05）；腹主动脉部分缩窄1周后，SBP继续升高，LVW/BW开始增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后2、4周，SBP和LVW/BW继续增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

心肌肥厚指心肌细胞体积增大，心肌纤维增生，或者心室重量增加[11]。实验按照文献[9]方法制做大鼠压力超负荷致心肌肥厚模型，选取不同的时间点进行观察。与假手术组相比较，腹主动脉部分缩窄组3 d时血压水平升高；1周时血压和心重指数增加，心肌细胞直径增大，排列不整齐，开始初步形成心肌肥厚；2周时血压和心重指数增加明显，心肌细胞排列较紊乱，体积增加，间质纤维化；4周时血压和心重指数增加显著，心肌细胞排列更加紊乱，间质纤维化明显，形成稳定的大鼠心肌肥厚模型。

近些年，研究者采用物理的、化学的及生物学等多种方法[12-14]制做动物心肌肥厚模型。严思敏等[15]利用腹主动脉缩窄法制做压力超负荷心肌肥厚大鼠模型，分别于术后2周和4周检测心脏指数、左心室指数，4周后模型组这两项指标较假手术组显著升高；丁同斌等[16]通过腹主动脉缩窄术制做大鼠心肌肥厚模型，4周后测定心脏指数升高，模型组心肌明显肥厚。这些研究与本实验结果一致。王婷等[17]采用腹主动脉缩窄法制做大鼠压力超负荷模型，分别于6周和12周后制作大鼠心肌组织切片，结果显示与假手术组相比，模型组大鼠在第6周出现明显心肌肥厚，而本实验是在第4周形成稳定的心肌肥厚模型，可能与王婷等[17]研究者没有设置4周观察点有关，本研究将在后续实验中增加6周时间点进行观察比较。同时由于实验条件所限，本研究没有采用心脏超声评价心肌肥厚程度，后续实验会进行改进。郭志坤等[18]利用背部皮内注射异丙肾上腺素4 mg/（kg·d）制做SD大鼠心肌肥厚模型，注射1、4、8周，测定大鼠体重、心脏重和左室重；制作心肌组织冷冻切片，利用图像分析软件测定心肌细胞横径和横截面积，免疫组织化学方法检测心肌组织的Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达。结果显示，异丙肾上腺素注射1周后，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达显著增多，4周后趋于稳定。化学造模方法简单，成功率高，死亡率低，但却不能完全模拟临床病理变化过程。黄颖等[19]观察到8周龄雄性自发性高血压大鼠SHR血压升高但没有出现心肌肥厚，17周龄雄性SHR左心室心肌细胞肥大，心肌间质增多，心脏重、左室重及左心室心肌细胞横径增大。陈柏荣等[20]对20周龄雄性SHR干预4周后，通过测定尾动脉血压、左室质量指数和超声心动图评价心肌肥厚程度。大量文献[19-20]研究表明选取SHR制作心肌肥厚模型时，大鼠需要培育到20周龄左右，实验耗时长，成本高。就造模周期而言，本研究选取Wistar大鼠制作心肌肥厚模型较为经济。

综上所述，腹主动脉部分缩窄术这种经典的造模方法目前使用较广，是研究心肌肥厚较为理想的模型。

[参考文献]

[1] Wright JW，Mizutani S，Harding JW. Pathways involved in the transition from hypertension to hypertrophy to heart failure. Treatment strategies [J]. Heart Fail Rev，2008，13（3）：367-375.

[2] Kehat I，Molkentin JD. Molecular pathways underlying cardiac remodeling during pathophysiological stimulation [J]. Circulation，2010，122（25）：2727-2735.

[3] 赵明月，秦育培，陆立慧，等.压力超负荷所致心肌肥厚中程序性坏死的初步研究[J].生物医学工程学杂志，2015， 32（3）：618-623.

[4] Martinho-Dias D，Leite-Moreira A，Castro-Chaves P. Calreticulin in the heart：from embryological development to cardiac pathology [J]. Curr Mol Med，2016，16（1）：12-22.

[5] Huai Y，Wang H，Zhao L，et al. Lacidipineinbits endoplasmic reticulum stress and myocardial remode-ling induced by pressure overload in rat heart [J]. Eur J Pharmacol，2013， 718（1/3）：441-447.

[6] Cao BQ，Yu Q，Zhao W，et al. Kallikrein-related peptidase 8 is expressed in myocardium and induces cardiac hypertrophy [J]. Sci Rep，2016，6：1-16.

[7] Marketou ME，Parthenakis F，Vardas PE. Pathological left ventricular hypertrophy and stem cells：current evidence and new perspectives [J]. Stem Cells Int，2016，2016：5720758.

[8] Wang N，Cao YS，Zhu Y. Netrin-1 prevents the development of cardiac hypertrophy and heart failure [J]. Mol Med Rep，2016，13（3）：2175-2181.

[9] Cardin S，Guasch E，Luo X，et al. Role for MicroRNA-21 in atrial profibrillatory fibrotic remodeling associated with experimental postinfarction heart failure [J]. Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5（5）：1027-1035.

[10] Aurora AB，Mahmoud AI，Luo X，et al. MicroRNA-214 protects the mouse heart from ischemic injury by controlling Ca2+ overload and cell death [J].J Clin Invest，2012，122（4）：1222-1232.

[11] Anderson PG，Allard MF，Thomas GD，et al.Increased ischemic injury but decreased hypoxic injury in hypertrophied rat heart [J]. Cir Res，1990，67（4）：943-946.

[12] Huang MH，Lui CY，Abusaid GH，et al. Cardiac calcitonin gene-related peptide and left ventricular hypertrophy in the cardiac allograft [J]. J Heart Lung Transplantation，2010，29（4）：487-488.

[13] 程杰坤，李乐.心肌肥厚动物模型建立方法研究进展[J].中国药房，2015，18（25）：3584-3587.

[14] 吴思媛，陆立慧，赵明月，等.钙网蛋白在压力超负荷心肌肥厚中的作用研究[J].生物医学工程学杂志，2016， 33（3）：512-519.

[15] 严思敏，吴双，孙丽，等.大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达[J].中南大学学报：医学版，2014，39（2）：124-128.

[16] 丁同斌，简立国，张丽华，等.瑞舒伐他汀对心肌肥厚大鼠心肌组织Beclin-1蛋白表达的影响[J].郑州大学学报：医学版，2016，51（2）：251-254.

[17] 王婷，柴春艳，王甜，等.HIF-1α在压力过负荷大鼠心肌组织中的表达[J].心脏杂志，2015，27（6）：662-665.

[18] 郭志坤，武俊芳，單卫华，等.异丙肾上腺素诱导的大鼠肥厚心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达[J].解剖学报，2012，43（1）：92-97.

[19] 黄颖，伍伟锋.自发性高血压大鼠左心室肥厚心肌微小RNA-1及微小RNA-133的差异表达[J].中华高血压杂志，2014，22（12）：1157-1161.

[20] 陈柏荣，刘茂，罗礼云，等.Apelin-13对自发性高血压大鼠心肌肥厚的影响[J].临床和实验医学杂志，2016，15（9）：825-829.

（收稿日期：2016-12-23 本文编辑：苏 畅）