高乌甲素对脊髓损伤大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α水平的影响

黄维艳 侯明勇 欧珊

(1.成都中医药大学 研究生院 四川 成都 610075；2.成都军区总医院 麻醉科 四川 成都 610083；3.成都市第一人民医院 麻醉科 四川 成都 610041)

·论 著·

高乌甲素对脊髓损伤大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α水平的影响

黄维艳1，2侯明勇3欧珊3

(1.成都中医药大学 研究生院 四川 成都 610075；2.成都军区总医院 麻醉科 四川 成都 610083；3.成都市第一人民医院 麻醉科 四川 成都 610041)

目的 观察高乌甲素(LA)对脊髓损伤(SCI)大鼠脊髓含水量以及脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平的影响及其神经保护功能。方法 240只雄性SD大鼠按随机数表法分为SCI组，SCI+生理盐水组(saline组)、SCI+LA组(LA组)和SCI+甲强龙组(MP组)，每组60只。每组含有时间点为1、3、6、12、24 h。LA组术后腹腔注射LA，4 mg/kg；saline组术后腹腔注射生理盐水，4 mg/kg；MP组术后立即按首次剂量30 mg/kg腹腔注射，1 h后按5.4 mg/(kg·h)给药，计23 h总量，分4次腹腔注射完毕。在各时间点对各组大鼠进行脊髓含水量测定和脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平检测。结果 SCI发生后各组各时间点的脊髓含水量明显增加，其中在术后24 h，LA组及MP组脊髓含水量与SCI组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)。SCI后各组各时间点的脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显增加；在术后3、6、12、24 h，MP组及LA组的脊髓TNF-α水平低于SCI组，差异有统计学意义(P<0.05)；在术后3、6、12、24 h，MP组及LA组脊髓IL-10水平高于SCI组，差异有统计学意义(P<0.05)；在术后各时间点，LA组的脊髓IL-1β水平低于SCI组，差异有统计学意义(P<0.05)；在术后6、12、24 h，MP组脊髓IL-1β水平低于SCI组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LA及MP可减轻SCI大鼠的脊髓水肿程度，降低脊髓IL-1β、TNF-α水平，升高IL-10水平，对SCI大鼠具有神经保护作用。

脊髓损伤；高乌甲素；水肿；细胞因子

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种常见的外伤，原发性损伤的治疗效果不佳，而继发性损伤是其治疗的主要方向[1]。脊髓继发性损伤的复杂病理生理过程是导致治疗效果不佳的重要因素[2]。大量研究表明，免疫炎症反应作为一个重要的病理过程，参与了继发性SCI，抗炎治疗现已成为一种重要的SCI药物治疗方法。既往研究表明高乌甲素(lappaconitine，LA)对神经痛大鼠[3]和创伤性脑损伤大鼠有神经保护作用，对炎症大鼠有抗炎消肿及免疫调节的作用，对脓毒症患者有免疫抗炎的作用[4]，但是LA并未在SCI的治疗中得到应用。本研究采用大鼠脊髓钳夹损伤模型，观察LA对SCI的抗炎作用，并进一步探讨LA对SCI大鼠急性期脊髓水肿程度及脊髓组织匀浆的细胞因子(IL-1β、IL-10、TNF-α)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 实验性清洁级SD雄性大鼠240只，体质量240～260 g，由成都达硕实验动物有限公司提供[动物许可证：SCXK(川)2008-24]。

1.1.2 药物和器械 ELISA试剂盒：依可赛生物科技(太仓)有限公司；LA：哈药集团三精制药股份有限公司；止血夹：上海医疗器械集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 按随机数表法分为SCI组、SCI+生理盐水组(简称saline组)、SCI+LA组(简称LA组)和SCI+MP组(简称MP组)，每组60只大鼠。每组含有时间点为1、3、6、12、24 h。

1.2.2 SCI模型制备 参照钳夹模型[5-6]建模：大鼠腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 mg)麻醉后，俯卧位固定大鼠，定位T10，用推毛器备皮，以T10为中心行后正中切口，剥离两侧椎旁肌，显露T9～T11椎板，使用蚊式血管钳咬除T10椎板至椎弓根，修整椎板边界，并清晰显露硬膜两侧缘。用止血夹(标定力为110 g)完全钳夹脊髓，维持1 min后小心撤去止血夹，并可见钳夹的硬膜有一明显血肿印记或见鼠尾及后肢抽搐摆动。止血彻底，冲洗伤口，逐层缝合关闭切口。上述全部操作均满足无菌要求。术中及术后烤灯取暖，至实验大鼠苏醒。

1.2.3 给药方法 LA组术后腹腔注射LA(4 mg/kg)[3]；saline组术后立即腹腔注射生理盐水(4 mg/kg)；MP组术后立即开始进行腹腔注射，按首次剂量30 mg/kg腹腔注射，1 h后按5.4 mg/(kg·h)给药，计23 h总量，分4次腹腔注射完毕[7]；SCI组不进行药物注射。

1.3 检测指标

1.3.1 脊髓含水量测定 采用干湿重法测定各组大鼠的各时间点脊髓含水量比例，在各时间点取各组大鼠6只腹腔注射4%水合氯醛(2 ml/100 mg)麻醉后，取以T10为中心的脊髓组织约0.2 g，准确称重后，置于100 ℃烤箱中烘烤24 h至恒重后称取脊髓干重(精确度为0.01 g)，根据以下公式计算脊髓组织含水量百分比：脊髓组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%[8]。

1.3.2 脊髓组织匀浆IL-1β、IL-10、TNF-α水平检测 在各时间点取各组大鼠6只腹腔注射4%水合氯醛(2 ml/100 mg)麻醉后，取以T10为中心的脊髓组织约0.2 g，称重后于4 ℃环境下冰浴加生理盐水制成1∶10匀浆(4 000 rmp，10 min)，取上清液于标记好的EP管中，放于-80 ℃的冰箱保存。操作严格按试剂盒说明书进行，用ELISA测定IL-1β、IL-10、TNF-α的水平。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓含水量变化 SCI后各组各时间点的脊髓含水量明显增加，其中可见术后1 h脊髓含水量缓慢上升并在24 h达到最大值。在术后各时间点，SCI组的脊髓含水量与saline组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在术后各时间点，LA组的脊髓含水量与MP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在术后24 h，LA组和MP组的脊髓含水量与SCI组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)。

2.2 各组大鼠脊髓组织匀浆IL-1β、IL-10、TNF-α水平检测 SCI后各时间点脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显增加，且在所观察的时间点中在术后24 h达到最高水平。在术后各时间点，SCI组的脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平与saline组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在术后各时间点，LA组的脊髓IL-1β和TNF-α水平与MP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在术后6、12、24 h，MP组的脊髓IL-1β水平与SCI组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在术后各时间点，LA组的脊髓IL-1β水平与SCI组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在术后3、6、12、24 h，MP组和LA组脊髓IL-10、TNF-α水平与SCI组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在术后3、6、12、24 h，LA组的脊髓IL-10水平与MP组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平变化情况比较

注：与SCI组相比，aP<0.05，bP<0.01；与MP组相比，cP<0.05。

3 讨论

LA是提取自高乌头根的活性成分，是我国首创的非成瘾、非阿片类镇痛药，一直以来主要作为镇痛药用于临床。近年随着对LA的临床和实验研究的深入，发现LA还有抗炎消肿的作用[9]。已有大量研究证明LA对多种炎症模型导致的毛细血管通透性增高及渗出、肿胀等有明显的抑制作用，可消除耳廓、足趾、关节、下肢肿胀，抑制球内芽肿形成[10]。LA的作用强度是阿司匹林的66倍。4 mg/kg的LA的抗炎消肿作用强度相当于50 mg/kg氨基比林[11]。

本研究中各组在SCI后各时间点的脊髓含水量均升高，说明本研究中采用的SCI模型引起了创伤后水肿。值得注意的是，SCI+LA组及SCI+MP组在术后1 d的脊髓含水量明显低于SCI组，表明LA及MP能显著减轻SCI引起的水肿程度。研究证明，SCI的继发性损伤可引起炎症反应，同时炎症反应也会加重继发性损伤。细胞因子作为体内重要的炎性介质，在SCI后的炎症级联反应中起着重要作用。IL-1β是一种具有多种生物学功能的炎性细胞因子，SCI后IL-1β表达升高，可加重炎症反应，启动凋亡基因的表达，诱导神经元、少突胶质细胞和星形细胞凋亡，引起水肿，并刺激及协同NF-κB、TNF-α、INF-γ上调黏附分子的表达[8,12]。IL-10是一种多功能、多细胞源性的抗炎细胞因子，可抑制诸如TNF-α、IL-1等多种致炎细胞因子的合成，抑制炎性细胞的激活及向损伤区域迁移，与其他抗炎细胞因子具有协同作用，是多个炎症反应的重要环节，能够减轻SCI后炎症的发生，还可以降低星形胶质细胞产生的TNF-α以及星形胶质细胞和小胶质细胞递呈的抗原，对SCI引起的继发性损伤具有潜在的治疗作用[13]。TNF-α是SCI发生后最早升高的细胞因子，并能协同及促进其他促炎细胞因子的表达，而且可能是多种促炎因子的重要启动因素；能激活胶质细胞，导致胶质增生和瘢痕形成；产生潜在的神经毒性代谢产物一氧化氮和喹啉酸；促进释放花生四烯酸代谢物，并和脂过氧化物及氧自由基的产生有关；破坏血脊髓屏障；可诱导SCI后的神经元和胶质细胞凋亡，对少突胶质细胞具有毒性作用，并影响神经功能[14]。在本研究中，各组脊髓IL-1β、IL-10、TNF-α水平在SCI发生后明显升高，术后1 h即可看到表达上调，在24 h达到最大值，且与脊髓水肿程度变化趋势一致[15-16]，进一步说明SCI发生后IL-1β、TNF-α水平变化与SCI程度呈正相关[6]。LA及MP均能降低SCI所升高的脊髓含水量的比例，能抑制SCI引起IL-1β、TNF-α水平的升高，同时能升高IL-10水平。

总之，本研究结果表明，LA及MP均能通过降低脊髓含水量，减轻脊髓充血水肿，降低SCI发生后的脊髓IL-1β、TNF-α水平和升高脊髓IL-10的水平，减轻过度炎症反应，促进SCI大鼠创伤后神经功能恢复，减轻继发性损伤，对SCI大鼠具有神经保护作用。此外，LA与MP治疗SCI的炎症反应的效果无明显差异，但是MP近来因其不良反应受到质疑，不再推荐用于SCI，所以LA在SCI治疗中必将有广阔的应用前景。

[1] Abdullahi D,Annuar A A,Mohamad M,et al.Experimental spinal cord trauma: a review of mechanically induced spinal cord injury in rat models[J].Rev Neurosci,2017,28(1):15-20.

[2] Han X,Lu M,Wang S,et al.Targeting IKK/NF-κB pathway reduces infiltration of inflammatory cells and apoptosis after spinal cord injury in rats[J].Neurosci Lett,2012,511(1):28-32.

[3] Ou S,Zhao Y D,Xiao Z,et al.Effect of lappaconitine on neuropathic pain mediated by P2X3 receptor in rat dorsal root ganglion[J].Neurochem Int,2011,58(5):564-573.

[4] 郭鸿,尹超,张磊,等.高乌甲素对 ICU 脓毒症患者免疫功能的影响[J].中国急救医学,2015,(6):498-500.

[5] 李经辉,黄辉,吴海鹰,等.钳夹型急性大鼠脊髓损伤模型的建立与评价[J].昆明理工大学学报自然科学版,2012,37(6):67-71.[6] 邹明明.姜黄素对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的干预作用及其机制研究[D].重庆:第三军医大学,2011.

[7] Gokce E C,Kahveci R,Atanur O M,et al.Neuroprotective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides against traumatic spinal cord injury in rats[J].Injury-international Journal of the Care of the Injured,2015,46(11):2146-2155.

[8] Zhou W,Yuan T,Gao Y,et al.IL-1β-induces NF-κB and upregulates microRNA-372 to inhibit spinal cord injury recovery[J].J Neurophysiol,2017,15:jn.00936.2016.

[9] 魏华波,张宝华,谭兵,等.氢溴酸高乌甲素的药理作用及临床应用研究进展[J].重庆医学,2014,43(20):2660-2662.

[10]Wang Y Z,Xiao Y Q,Zhang C,et al.Study of analgesic and anti-inflammatory effects of lappaconitine gelata[J].J Tradit Chin Med,2009,29(2):141-145.

[11]Liu J H,Zhu Y X,Tang X C.Anti-inflammatory and analgesic activities of N-deacetyllappaconitine and lappaconitine[J].Zhongguo Yao Li Xue Bao,1987,8(4):301-305.

[12]Boato F,Rosenberger K,Nelissen S,et al.Absence of IL-1β positively affects neurological outcome, lesion development and axonal plasticity after spinal cord injury[J].J Neuroinflammation,2013,10:6.

[13]Thompson C D,Zurko J C,Hanna B F,et al.The therapeutic role of interleukin-10 after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2013,30(15):1311-1324.

[14]Tyor W R,Avgeropoulos N,Ohlandt G,et al.Treatment of spinal cord impact injury in the rat with transforming growth factor-beta[J].J Neurol Sci,2002,200(1-2):33-41.

[15]李想,王少波.脊髓损伤后炎症性细胞因子表达的变化及甲基强的松龙的影响[J].中国康复理论与实践,2005,11(2):91-93.

[16]庄志,顾红兵,朱灿宏.IL-1和IL-6在脊髓损伤大鼠神经细胞中的表达及其动态变化[J].医药论坛杂志,2010,31(23):38-40.

Effects of lappaconitine on IL-1β, IL-10 and TNF-α levels in rats with spinal cord injury

Huang Weiyan1,2, Hou Mingyong3, Ou Shan3

(1.GracluateSchool,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610083,China; 3.DepartmentofAnesthesiology,ChengduFirstPeople'sHospital,Chengdu610041,China)

Objective To observe the effect of lappaconitine (LA) on the water content of spinal cord and the spinal cord levels of IL-1β, IL-10 and TNF-α in rats with spinal cord injury (SCI) as well as its neuroprotective function. Methods A total of 240 male Sprague - Dawley rats were randomly divided into SCI group, SCI + saline group (saline group), SCI + LA group (LA group) and SCI + Methylprednisolone group (MP group). With 60 rats in each group, each group contained time points 1, 3, 6, 12, 24 h. The rats in the LA group were injected intraperitoneally immediately with LA (4 mg/kg); the rats in the saline group

intraperitoneal injection of normal saline, 4 mg/kg; the rats in the MP group were injected intraperitoneally immediately with the first dose of 30 mg/kg MP, then were administered according to 5.4 mg/ (kg·h), total amount of 23 h, divided into four injections. The water content of spinal cord and the levels of IL-1β, IL-10 and TNF-α in the spinal cord were measured at each time point. Results Spinal cord water content was significantly increased after SCI. The water content of the spinal cord in LA group and MP group was significantly lower than that in SCI group at the 24 h after SC injury (P<0.01). After SCI injury, the IL-1β, IL-10 and TNF-α levels in the spinal cord increased significantly in each group. At 3, 6, 12, 24 h after SCI, the TNF-α levels of the spinal cord in LA group and MP group were significantly lower than SCI group (P<0.05). At 3, 6, 12, 24 h after SCI, the IL-10 levels in the spinal cord in LA group and MP group were significantly higher than SCI group (P<0.05). The IL-1β levels of spinal cord in the LA group were significantly lower than SCI group at each time point after operation (P<0.05). The IL-1β levels of spinal cord in the MP group were significantly lower than that in SCI group at 6, 12, 24 h after operation (P<0.05). Conclusion LA and MP can attenuate the water content of spinal cord after SCI injury, decrease the levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord and improve the levels of IL-10 of the spinal cord, so as to play a neuroprotective role in SCI rats.

spinal cord injury；lappaconitine；water content; cytokines

黄维艳，E-mail：1018878938@qq.com。

R 965

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.10.001

2017-01-26)