鲤鱼2种脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆、表达及活性研究

喻文娟，俞菊华，，李红霞，李建林，唐永凯，于 凡 ，何 枫，傅纯洁

(1．南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；2.中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心,农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏 无锡 214081；3.东海县水产技术推广站，江苏 东海 222300)

鲤鱼2种脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆、表达及活性研究

喻文娟1，俞菊华1，2，李红霞2，李建林2，唐永凯2，于 凡2，何 枫1，傅纯洁3

(1．南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；2.中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心,农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，江苏 无锡 214081；3.东海县水产技术推广站，江苏 东海 222300)

为探究脂酰辅酶A脱氢酶对脂肪酸β氧化的调控机制，使用RT-PCR 在鲤鱼肝脏克隆了脂酰辅酶A脱氢酶家族中的MCAD和LCAD全长cDNA序列，阅读框分别为1 275，1 326 bp，编码424,441个氨基酸，分析表明他们均具备ACADs家族的特征序列：FAD结合位点、底物结合位点、催化位点等，与斑马鱼MCAD和LCAD的一致性分别为93.16%和94.56%。实时定量RT-PCR结果表明，MCAD和LCAD主要在肝脏和心脏表达；不同脂肪源对MCAD的表达没有明显影响，但鱼油对LCAD的表达有明显的刺激作用。此外，构建了原核表达载体MCADs-pEASY(E2)和LCADs-pEASY(E2)，经IPTG诱导获得了原核表达蛋白，分子量分别为43.0，43.6 kDa。经检测这2个蛋白在370，450 nm处有明显的吸收峰，表明他们能自然结合FAD辅基。吩嗪硫酸甲酯反应法结果表明：MCAD和LCAD酶活性最适温度均为28 ℃，酶活分别为9.12，10.29 U/g。结果表明，与哺乳动物类似，鲤鱼MCAD和LCAD在肝脏和心脏表达量高；高不饱和脂肪酸对LCAD的表达有促进作用。

鲤鱼；MCAD；LCAD；克隆；原核表达；酶活性

脂酰辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA dehydrogenases，ACADs)是以黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，FAD)为辅基的酶，主要参与线粒体脂肪酸、氨基酸等代谢过程。该酶首先在细胞核编码，然后在细胞质中合成比成熟蛋白大2～4 kDa具有前导肽的蛋白质前体，并转移到线粒体中，最后通过蛋白水解过程将氨基端的前导肽切除而成为成熟的蛋白[1]。脂肪酸的氧化是动物、许多原生生物及一些细菌获得能量的主要代谢途径，人体内大约30%的能量来源于脂肪酸的氧化代谢，氧化方式有β氧化、丙酸氧化、α氧化、ω氧化等[2]。在正常生理条件下，线粒体脂肪酸β氧化是脂肪酸氧化的主要的代谢途径，第一步反应由ACADs所催化。ACADs家族成员有11个亚型，他们的分子量、结构以及分布不同，且各有特性。其中短链脂酰辅酶A脱氢酶(Short-chain Acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)、中链脂酰辅酶A脱氢酶(Medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)、长链脂酰辅酶A脱氢酶(Long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，LCAD)、极长链脂酰辅酶A脱氢酶(Very-long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD)和脂酰辅酶A脱氢酶9(9-Acyl-CoA dehydrogenase，ACAD9)是催化各种长度直链脂肪酸β氧化第一步脱氢反应的重要酶。对动物或原核生物ACADs的研究发现，ACADs不仅参与真核生物β氧化过程，还可作为多种氨基酸(Ile、Leu、Val)的代谢酶类，以及催化辅酶A共轭脂肪酸的脱饱和反应；此外，在胁迫作用下ACADs基因上调表达还可能与细胞膜的组分调节等有关。人类的一些疾病与ACADs的缺乏有关，常见于急性病变，如急性病毒感染、各种毒素损伤、代谢障碍和急性的妊娠脂肪肝等；随着关于代谢综合征机制研究的进行，越来越多的因子已经发现ACADs的缺乏与代谢综合征、肥胖和胰岛素抵抗有着密切的关系。但对于ACADs的研究国内外刚刚起步，其中以细胞因子为切入点研究脂代谢紊乱、肥胖、肝脏脂肪变性的关系已成为当前的热点。

MCAD催化4～12个碳原子的脂酰辅酶A脱氢，最佳催化底物为8个碳原子的脂酰辅酶A(C8-CoA)，LCAD催化8～20个碳原子的脂酰辅酶A脱氢，最佳催化底物为16个碳原子的脂酰辅酶A(C16-CoA)[3]。研究表明，MCAD和LCAD的缺乏症会引起表现为代谢紊乱相似的疾病[4]，且还发现FAD结合位点、催化活性和理化性质是一致的。MCAD和LCAD基因从肝脏的研究现状来看[5]，在基因组成、氨基酸种类、酶的活性位点方面具有几个明显的同质性，这说明MCAD和LCAD在功能上具有一致性。关于MCAD和LCAD蛋白活性方面的研究，利用大肠杆菌进行表达，测量了不同温度、不同底物分子作用下对MCAD和LCAD酶活性的影响[6]，结果表明温度过高酶活性下降，在最适底物作用下酶活性最高。MCAD是这些脂酰辅酶脱氢酶中研究最为深入、最具代表性的一个[7]，直接参与线粒体脂肪酸β-氧化过程，这表明MCAD是脂肪酸氧化重要的参与和控制者，本试验对于其研究是具有意义的。此后，关于MCAD和LCAD多集中于代谢综合症，特别是对缺乏症的一系列研究。Bala等[8]通过几个案例表明MCAD缺乏时中链酰基肉碱或其他代谢产物的积累会引起心律失常。Yan等[9]对于LCAD在肝等疾病脂肪酸代谢上报道一项更新的研究，Hickmann等[10]的研究发现LCAD缺乏患者细胞中一元羧酸的蓄积会破坏肝脏线粒体的能量平衡，他们的研究都在一定程度上解释了影响患者肝脏病变的原因。Mccoin等[11]对LCAD有了一项新的研究，利用血液和尿液中的LCAD酶检测来诊断长链脂肪酸氧化障碍，新的研究结果表明LCAD酶对于脂肪酸氧化障碍的确诊有关键性的作用，对临床运用有很大的推动力。Rudolf等[12]对于LCAD中间体的研究发现,可以催化平极霉素和平极素的β氧化为新的天然药物研发提供可能性。也有研究显示线粒体LCAD的缺乏会导致脂肪酸氧化能力的下降而造成甘油二酯的蓄积和肝脏胰岛素抵抗[13]。目前，关于脂肪酸β氧化方面在人类和小鼠的研究中已有一定的基础而对于鱼类在脂肪酸β氧化方面的研究少有报道，对于鱼类MCAD和LCAD的克隆有一定的研究，比如罗非鱼、斑马鱼、大黄鱼和伯氏朴丽鱼等的cDNA序列都已经得到，但是对于鲤鱼MCAD和LCAD基因克隆、表达及活性研究未见报道。

近年来，脂肪酸β氧化过程中ACADs的缺失或突变而引起的脂肪酸氧化代谢紊乱的疾病较多，且脂肪酸在细胞内的蓄积，不仅可引起生物膜中磷脂所含脂肪酸种类的变化，而且还会产生大量的活性氧，损伤细胞的结构和功能。此外，真核生物体内器官、组织和细胞中包含着机体生长、发育和繁殖所需的遗传信息，但这些遗传信息并不全都表达，肝细胞表达的基因一般不超过20%，许多基因处于沉默状态；但当外界环境和自身条件发生改变时，比如，水温、水质变化，鱼体发育阶段、饲料营养变化等，机体内基因表达情况即会发生改变，调节机体内相对应的功能蛋白质的量，从而适应外界环境或自身条件的变化。因而脂肪酸氧化过程中ACADs结构及催化机理的研究将有助于相关疾病的诊断与治疗。

因此，本试验以鲤鱼(Cyprinuscarpio)为研究对象，利用RT-PCR、RACE克隆MCAD和LCAD基因的cDNA序列，并对MCAD和LCAD基因在不同组织、脂肪源等条件下的表达情况及温度对酶活性影响进行了分析，为研究脂肪酸代谢机理和鱼类营养需要，及由脂肪酸代谢引起的疾病的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼 鲤鱼取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，试验所用鱼为当年人工繁殖的同池养殖鱼种，平均体重70 g，体长10～15 cm。

1.1.2 主要试剂 Total RNA Kit、pMD18-T载体、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、 Competent Cell Preparation Kit、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、TaqDNA聚合酶等购自上海申能博彩生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT Master Mix购自Omega生物技术公司；pEASY-E2 Expression Kit购自北京全式金生物技术科技有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin购自金思特科技(南京)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp公司；millipore超滤管购自北京利华开顺贸易有限公司。C16∶0-CoA、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)购自上海生物工程股份有限公司。

1.1.3 引物 所有引物信息见表1，P1、P2用于扩增MCADcDNA序列，P5、P6为构建LCAD原核表达重组质粒设计的引物序列；P3、P4用于扩增LCADcDNA序列，P7、P8为构建LCAD原核表达重组质粒设计的引物序列。所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 使用的引物

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 根据OMEGA Total RNA Kit试剂盒说明，抽提鲤鱼各个组织中的Total RNA，以Oligo dT为引物反转录成cDNA。

1.2.2MCAD和LCAD基因编码区cDNA序列克隆 使用NCBI数据库检索已有的斑马鱼相关MCAD、LCAD基因序列，在本实验室已有的鲤鱼肝脏转录组中筛选到相关同源序列，根据此序列设计引物(P1-P2和P5-P6)。20 μL RT反应体系中加5 μg肝脏RNA，使用逆转录酶M-MLV，以Oligo dT为引物进行RT扩增，合成出cDNA第一条链。50 μL PCR反应体系中，以RT产物为模板，使用P1、P2和P5、P6进行扩增。经RT-PCR扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，再经克隆鉴定送至上海博尚生物有限公司进行测序、拼接，最终得到MCAD和LCAD基因完整的cDNA编码区序列。

1.2.3 序列分析 采用ExPASy在线工具对MCAD和LCAD的氨基酸理化性质进行预测分析；通过DNAMAN 6软件分析MCAD和LCAD的核苷酸序列并进行氨基酸同源序列比对；使用MEGA 5.1软件构建NJ系统发育树。

1.2.4MCAD和LCADmRNA组织表达 荧光定量选用SYBR Green作为结合染料，选用β-actin作为内标基因，通过溶解曲线检测产物的特异性。根据Real-time PCR分析结果，采用2-ΔΔCt法计算分析MCAD和LCAD基因在心脏、肝脏、脑、肌肉等组织中的表达情况。

1.2.5MCAD和LCAD不同脂肪源mRNA组织表达 以实时荧光定量PCR检测肝脏中MCAD和LCAD基因的表达量，选用β-actin作为内标基因，通过溶解曲线检测产物的特异性。根据Real-time PCR分析结果，采用2-ΔΔCt法计算分析MCAD和LCAD基因在不同脂肪源鲤鱼肝脏组织中的表达情况，并用SPSS 13.0软件及逆行分析。

1.2.6 原核表达蛋白纯化、复性 试验选用Transetta(DE3)表达菌株，选用pEASY(E2)表达载体，构建ACADs-pEASY(E2)-Transetta(DE3)原核表达系统。试验选用100 mL 2YT液体培养基，将扩大培养之后菌液转移至2YT中，在37 ℃，200 r/min条件下培养。当菌液浓度OD600达到0.5～0.8时，加入0.5 mmol/L的IPTG，28 ℃，160 r/min条件下诱导6 h后收集菌体，其中未加IPTG的菌体作为空白对照。诱导结束后，从对照组和试验组各吸取1 mL菌液，离心弃上清，用200 μL 1×PBS缓冲液打散菌体，加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，混匀，沸水煮20 min，4 ℃离心10 min，各取上清10 μL进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白表达结果。剩余菌液经4 ℃离心收集后，用1×PBS缓冲液洗涤沉淀2次，加入菌体裂解液，冰上超声破碎，收集超声后的液体，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min。上清液转移至EP管中，沉淀加入适量1×PBS缓冲液重悬。分别取200 μL上清和沉淀重悬液200 μL，加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，混匀，沸水煮20 min，离心取上清进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化采用镍柱亲和层析纯化方法，纯化的蛋白经过millipore超滤管(10 kDa)超滤之后，取200 μL清液，加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，混匀，沸水煮20 min，离心10 min，SDS-PAGE电泳分析。蛋白浓度测定采用Biosharp公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法。

1.2.7MCAD和LCAD活性测定 25 ℃孵育25 min后，使用酶标仪进行全波长扫描，波长为200～600 nm，检测FAD辅基的装载。

酶活力单位：酶活力单位的定义为25 ℃，pH值7.0的条件下，以每分钟催化1 μmol C18∶0-CoA所需的酶量为1个活力单位U。蛋白的活性测试采用吩嗪硫酸甲酯反应法[14]，脂酰辅酶A脱氢酶通过一系列人工电子受体，如与吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)发生反应催化脂肪酸的氧化，而借助中间产物颜色的变化，通过分光光度计检测即可定量。反应总体积200 μL，加入终浓度为20 mmol/L(pH值7.4)的磷酸缓冲液，1.5 mmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，48 μmol/L 2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)和10 μL蛋白在室温孵育。然后加入底物C16∶0-CoA，孵育25 min后监测600 nm波长处的吸收值变化。以不含酶的体系作为对照。

分别在20，25，28，30，33 ℃这5个不同温度，波长600 nm条件下孵育25 min后测定MCAD和LCAD的吸光值，然后计算酶活，确定最适反应温度。

2 结果与分析

2.1MCAD和LCADcDNA序列

MCADcDNA编码区全长1 275 bp，编码424个氨基酸；LCADcDNA编码区全长1 326 bp，编码441个氨基酸。ExPASy在线工具预测表明MCAD和LCAD蛋白的等电点分别为8.52和7.63，分子量分别为43.0，43.6 kDa。

2.2 MCAD和LCAD氨基酸序列一致性比较

使用DNAMAN软件，将MCAD和LCAD氨基酸序列与其他物种的MCAD和LCAD氨基酸序列进行同源性比较如图1，2。MCAD和LCAD氨基酸序列一致性为31.01%。再分别将MCAD和LCAD氨基酸序列与其他物种同种氨基酸序列进行一致性比较如表2。表2结果显示鲤鱼MCAD与哺乳动物人和原鸽的相似性分别为78.62%，82.61%，与斑马鱼相似性为93.16%，与西洋鲑、短鳍花鳉、罗非鱼、海龟、河豚的相似性分别为86.26%，83.89%，84.43%，79.72%，82.66%。表2结果显示鲤鱼LCAD与哺乳动物人和原鸽的相似性分别为70.70%，73.09%，与斑马鱼相似性为94.56%，与西洋鲑、短鳍花鳉、罗非鱼、海龟、河豚的相似性分别为75.91%，71.43%，76.64%，75.29%，72.87%。

表2 基于氨基酸序列鲤鱼MCAD和LCAD与其他物种的MCAD和LCAD的一致性

2.3 基于MCAD和LCAD氨基酸序列构建的系统发育

根据分离的MCAD和LCAD氨基酸序列以及在NCBI基因库中其他物种的相关序列，使用MEGA 5.1软件构建NJ系统发育树(图3)。该系统发育树中选用人LPL(Homosapiens)作为外群，其结果表明，鲤鱼MCAD和同为鲤形目的斑马鱼聚为一支，然后与西洋鲑、短鳍花鳉、罗非鱼、伯氏朴丽鱼、河豚、大黄鱼聚为一大支。鲤鱼LCAD和同为鲤形目的斑马鱼聚为一支，然后与斑点叉尾鮰聚为一小支，随后又与伯氏朴丽鱼、罗非鱼、西洋鲑、大黄鱼、河豚聚为一大支。

Cc.鲤鱼；Cg.黑线仓鼠；Cl.原鸽；Dr.斑马鱼； On.罗非鱼； Xm.剑鱼； Om.虹鳟； Mz.斑马宫丽鱼；Pr.孔雀鱼。 在序列中一致的氨基酸序列用黑色背影表示。正方形.蛋白激酶位点；单横线.蛋白激酶域；圆形.氨基糖苷憐酸转移酶结合位点；箭头.酯酰辅酶脱氧酶端； 三角形.酯酰辅酶脱氢酶端；五角星.谷氨酸催化活性位点。

Cc.Cyprinuscarpio；Cg.Cricetulusgriseus；Cl.Columbalivia;Dr.Danioreri；On.Oreochromisniloticus；Xm.Xiphophorusmaculatus；Om.Oncorhynch，usmykiss；Mz.Maylandiazebra；Pr.Poeciliareticulata. Black shading with white letters shows identical amino acid residues in sequences. Square. Protein kinasesite； Single line.Protein kinase domain； Round.Amino sugar flow acid transferase binding sites； Arrow.Ester；Triangles.Acyl coenzyme deoxidizingenzy me ester side acyl coenzyme dehydrogenase；Star.Glutamic acid catalytic activesite.

图1 鲤鱼MCAD与其他物种MCAD氨基酸序列比对图

Fig.1 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence ofCyprinuscarpio(Cc) MCAD with the corresponding sequences from other species

Cc.鲤鱼; Hs.人;Gg.鸡; Dr.斑马鱼; Ss.西洋鲑; Pm.短鳍花鳉;Xm.剑鱼;Ip.斑点叉尾鮰; Sr.犀牛金线鲅。在序列中一致的氨基酸序列用黑色背影表示。正方形.蛋白激酶位点;单横线.蛋白激酶域;圆形.氨基糖苷憐酸转移酶结合位点;箭头.酯酰辅酶脱氧酶端; 三角形.酯酰辅酶脱氢酶端;五角星.谷氨酸催化活性位点。

Cc.Cyprinuscarpio;Hs.Homosapiens;Cg.Cricetulusgriseus;Dr.Danioreri;Ss.Salmosalar;PmPoeciliaMexicana;Xm.Xiphophorusmaculatus;Ip.Ictaluruspunctatus;Sr.Sinocyclocheilusrhinocerous.Black shading with white letters shows identical amino acid residues in sequences. Square. Proteinkinasesite; Singleline.Proteinkinasedomain; Round.Aminosugarflowacidtransferasebindingsites; Arrow.Ester;Triangles.Acylcoenzymedeoxidizingenzymeestersideacylcoenzymedehydrogenase;Star.Glutamicacidcatalyticactivesite.

图2 鲤鱼LCAD与其他物种LCAD氨基酸序列比对图

Fig. 2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence ofCyprinuscarpio(Cc) LCAD with the corresponding sequences from other species

图3 基于MCAD和LCAD氨基酸序列的系统发育树

2.4MCAD和LCAD的组织表达

荧光定量RT-PCR分析结果显示，MCAD和LCADmRNA在不同组织中的相对表达量差异很大。其中MCAD在肝脏中表达量最高，其次为心脏、头肾、肾脏和脑，在其他组织中表达相对很少，在鳃中基本不表达；LCAD在心脏中表达量最高，在肝脏中表达量也比较高，但在其他组织中表达很少(图4)。

图4 MCAD和LCAD在组织中的相对表达量

2.5 不同脂肪源对肝脏MCAD和LCAD表达影响

荧光定量RT-PCR分析结果显示，不同脂肪源中肝脏MCAD和LCAD表达水平不同。其中MCAD在亚麻油和鱼油中表达量相对较高，在豆油和猪油中表达相对较少；LCAD在鱼油中表达量最高，在猪油中表达量其次，在亚麻油中表达比较少，在豆油中未见表达(图5)。

图5 MCAD和LCAD在不同脂肪源肝脏组织中的相对表达量

2.6MCAD和LCAD原核表达、蛋白纯化

2.6.1 蛋白表达的鉴定 近几年，通过原核表达的方式已经可以将线粒体脂肪酸β氧化的一些关键酶进行大量表达并纯化出来，如SCAD[22]、MCAD[23]。本试验，重组体pEASY(E2)-ACADs(MCAD和LCAD蛋白分子量分别为43.0，43.6 kDa，在Transetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后实现了特异性融合蛋白表达。对收集的菌体超声破碎，离心后得到的上清液和沉淀分别进行电泳，确定MCAD和LCAD主要以包涵体的形式存在(图6)。

M.预染蛋白Marker； 1.上清液中MCAD的表达； 2.包涵体中MCAD的表达； 3.包涵体中LCAD的表达； 4.上清液中LCAD的表达。

M. Prestained protein Marker； 1. The expression of MCAD in the supernatant； 2.The expression of MCAD in the including； 3.The expression of LCAD in the including； 4.The expression of LCAD in the supernatant.

图6 蛋白可溶性鉴定

Fig.6 Soluble identification of proteins

2.6.2 MCAD和LCAD蛋白纯化 经过镍柱亲和层析纯化的蛋白，经SDS-PAGE电泳检测后得到单一条带(图7)。纯化后的蛋白经浓缩之后，BCA蛋白测定得MCAD的浓度为0.86 μg/μL，LCAD的浓度为0.90 μg/μL。

M.预染蛋白Marker；1.MCAD纯化后的蛋白；2.LCAD纯化后的蛋白。

2.7 MCAD和LCAD原核表达蛋白活性测定

检测FAD装载：分别取MCAD和LCAD蛋白20 μL用双蒸水稀释至200 μL，进行200～600 nm波长下紫外扫描。扫描结果如图8所示，280 nm处有明显的蛋白吸收峰，且该蛋白在370，450 nm存在吸收峰。由于370，450 nm是FAD辅基的标准吸收峰，表明FAD辅基已装载。

2.8 温度对MCAD和LCAD酶活性的影响

由图9可以看出，MCAD酶活性的最适温度在28 ℃左右，LCAD酶活的最适温度也在28 ℃；此时酶活性分别为9.12,10.,29 U/g。MCAD和LCAD都是有活性的蛋白，温度过高或者过低对于酶活的影响都是比较大的，MCAD和LCAD酶活性在随着温度的升高而增强，达到最适温度后又随着温度的升高而减弱。

图8 不同波长下的蛋白吸收值

图9 不同温度下蛋白酶活性

3 讨论与结论

3.1MCAD和LCAD基因序列

本研究克隆了MCAD和LCAD开放阅读框cDNA序列，序列分析表明MCADcDNA编码区全长1 275 bp，编码424个氨基酸；LCADcDNA编码区全长1 326 bp，编码441个氨基酸。本研究克隆的MCAD和LCAD主要功能域包含蛋白激酶位点、蛋白激酶域(单横线)、氨基糖苷磷酸转移酶结合位点、酯酰辅酶脱氧酶端、酯酰辅酶脱氢酶端、谷氨酸催化活性位点。研究结果与小鼠SCAD[15]的ACADS的催化活性位点和植物油茶[16]ACADs的活性位点分析一致，表明MCAD和LCAD具有ACADs家族的共同特点；即底物结合位点(S228、F335、L342、N343、R346、F456和e457)用于固定催化底物，FAD结合位点(F219、L221、T222、G227、S228、W254、S256、I462、T469和D471)用于固定辅酶FAD，一个高度保守的谷氨酸残基(Glu376)作为催化位点[17]。氨基酸序列上与其他鱼类比对比较保守，而对MCAD和LCAD一致性分析可知相似性比较低只有30.01%，其基本功能FAD功能区等却极为相似[18]，这与其他物种的研究结果基本一致，这可能是由于功能选择性表达导致的。通过系统发育树可见鲤鱼MCAD哺乳动物MCAD聚为一支，鲤鱼LCAD和西洋鲑、斑点叉尾鮰聚为一支，这表明MCAD和LCAD在进化过程中出现了不同的进化方向，这些可能是鱼类特有的3轮全基因组复制的结果。

3.2MCAD和LCAD在各组织中的表达

ACADs是由组织中的实质细胞合成后分泌到胞外的，同一种组织合成的MCAD和LCAD不会通过血液循环系统运送到其他组织中发挥作用。这在一定程度上确保了用荧光定量技术检测MCAD和LCAD各组织中表达量的准确性。MCAD和LCAD均在肝脏和心脏高表达，这与人体中的高表达组织是一致的[19]，这说明本试验可信度很高，主要是由于这些组织富含线粒体。不同组织中，MCAD和LCAD表达的水平并不完全相同，可能与长期进化时不同组织中MCAD和LCAD在脂肪代谢中作用程度不同有关。

3.3 不同脂肪源对肝脏MCAD和LCAD的表达影响

MCAD和LCAD肝脏mRNA在不同脂肪源的相对表达量水平不同。其中MCAD在鱼油、豆油、亚麻油这3组相对表达量高于猪油，但这3组之间无显著差异；LCAD在鱼油和猪油这2组相对表达量不同。脂肪源的差异实质上就是脂肪酸组成及比例(n-3/n-6)的差异，从本试验各组饲料脂肪源组成发现，鱼油富含n-3型多不饱和脂肪酸(n-3，PUFA)、EPA和DHA；豆油富含棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸；亚麻油富含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸；猪油富含大量饱和脂肪酸。研究发现，MCAD催化4～12个碳原子的脂酰辅酶A脱氢，最佳催化底物为8个碳原子的脂酰辅酶A(C8-CoA)，LCAD催化8～20个碳原子的脂酰辅酶A脱氢，最佳催化底物为16个碳原子的脂酰辅酶A(C16-CoA)[18]；在小鼠的研究中发现MCAD催化能力只有LCAD的1.2%，脂酰辅酶A脱氢酶催化不同长度脂肪酸的能力是棕榈酸>花生四烯酸>二十二碳六烯酸>辛酸[20]；同时黄鳝和罗非鱼利用豆油的能力与鱼油接近，优于猪油，这与本试验的研究结果一致，说明笔者的结果是具有信度的。从试验结果来看，这可能与MCAD和LCAD主要催化不同碳原子的脂肪酸有关。MCAD的结果可能是鱼油、豆油、亚麻油都富含不饱和脂肪酸而猪油组富含不饱和脂肪酸，因此，MCAD对饱和脂肪酸的催化能力优于不饱和脂肪酸而导致猪油组中的MCAD表达量低；LCAD结果显示LCAD肝脏mRNA在鱼油组表达量很高，这与鱼油组富含DHA和EPA有关，而其高于猪油组，可能与猪油组多含43个碳原子的不饱和脂肪酸而LCAD由于脂肪酸碳链过长无法催化有关。由此推测，MCAD和LCAD肝脏mRNA在不同脂肪源的相对表达量表示的是MCAD和LCAD对不同长度碳原子脂肪酸的选择催化能力。

3.4MCAD和LCAD原核表达

本研究选用高效表达载体pEASY-E2，将MCAD和LCAD基因目的片段与其相连接，成功构建了pEASY(E2)-MCAD、pEASY(E2)-LCAD原核表达载体，在大肠杆菌Transetta(DE3)中于28 ℃经过0.5 mmol/L的IPTG诱导8 h之后，高效表达出相对分子量约为43.0 kDa的融合蛋白，随后经过Ni-NTA亲和层析蛋白纯化、复性、超滤，获得了高纯度的融合蛋白。

3.5 温度对MCAD和LCAD酶活的影响

目前，关于脂肪酶活性的测定方法有很多种，如碱滴定法、对硝基苯酚法、铜皂法[21]。本研究蛋白的活性测试采用的是吩嗪硫酸甲酯反应法测定了原核表达纯化蛋白MCAD和LCAD在底物充足的情况下，不同温度范围内的酶活。

鱼类属于变温动物，环境温度变化直接影响着鱼类机体内的生理生化反应，进而影响鱼体生长发育的情况。鱼类消化酶活性受温度影响已有很多研究报道，一般认为，水温升高能够提高鱼的各种生理代谢强度，消化系统的代谢强度也增强，消化酶的基础分泌会增加；另一方面，鱼的摄食量会随着环境温度上升而增加，鱼类消化酶的分泌活性与饱食程度有关。鱼类消化酶主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等几种，其活性随种类、生长阶段和健康状况的不同而有所差异，同时受外界环境因子诸如温度、盐度、pH值及重金属离子的影响[22]。有研究表明[23]，鱼类消化酶的最适温度一般为30～50 ℃；黄燕华等[24]对虾的研究表明肝胰脏脂肪酶的最适温度为30 ℃；李加儿等[25]的研究表明斜带髭鲷(Hapalogenysnitens)消化道不同部位脂肪酶活性的最适温度均为35℃；郭娟等[26]对同属于鲤科鱼类团头鲂的研究表明脂肪酶的最适温度为50 ℃，本研究MCAD和LCAD酶活的最适温度与上面研究结果有一定的差异，表明不同种鱼不同消化器官的不同消化酶，其适宜温度各不相同，也有可能与在体外克隆与原核表达时其谷氨酸活性位点的突变有关。鲤鱼生长的适宜温度是20～28 ℃，从ACADs活性的最适温度与环境温度相比较来看，水体环境的温度难以维持ACADs活性所需要的最适温度，这一点与倪寿文[27]在研究温度与鱼消化酶作用关系时的结论相近似，虾类也存在类似现象[28]。究其原因，可能跟鲤鱼体内复杂的环境有关，而且试验中测定的ACADs活性是在一定的限制性条件下进行的，所以最适温度只有在一定的条件下才会有意义，也在一定程度上反映了温度对ACADs的表达具有一定影响。

3.6 结论

脂酰辅酶A脱氢酶是催化各种长度直链脂肪酸β氧化第一步脱氢反应的限速酶，而线粒体脂肪酸β氧化是脂肪酸氧化的主要的代谢途径。目前，MCAD和LCAD在哺乳动物中研究较多，而在鱼类尚无深入探讨且非常有限。本研究克隆并获得鲤鱼MCAD和LCAD全长，通过与斑马鱼比对，其同源性高达93.16%和94.56%，表明该基因家族在物种进化中较为保守；组织表达研究表明MCAD和LCAD在富含线粒体且脂肪酸代谢旺盛的组织器官：心脏和肝脏中表达较高，而在其他组织中表达量较少；Real-time试验结果表明，在不同脂肪源营养条件下，MCAD和LCAD在富含最佳长度脂肪酸的脂肪源作用明显增强，对脂肪酸β氧化起关键调控作用。此外温度对MCAD和LCAD的影响比较大，温度对其活性的影响呈现先上升后下降的趋势，表明养殖最适温度28 ℃左右。综上所述，本研究初步证实MCAD和LCAD在鲤鱼肝脏中对脂肪酸β氧化具有关键调控作用，并为改善鲤鱼饲料配方和养殖条件提供了实验基础和科学依据。

致谢：感谢在实验期间帮助我的导师俞菊华和师兄周杰，谢谢你们对试验的关键性协助和对我个人生活方面的关心，这对于本实验的完成都至关重要。对你们献上我最诚挚的谢意！

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Cloning，Expression and Activity Analysis of Two Kinds ACADs inCyprinuscarpio

YU Wenjuan1，YU Juhua1，2，LI Hongxia2，LI Jianlin2，TANG Yongkai2，YU Fan2,HE Feng1,FU Chunjie3

(1. Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi 214081，China； 2. Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater，Ministry of Agriculture，Wuxi 214081，China；3.Donghai Fisheries Technical Extension Station，Donghai 222300,China)

To investigate the regulatory mechanism of fatty acids fatty Acyl coenzyme A (Acyl-CoA dehydrogenase，ACADs) on fatty acids β-oxidation in mitochondrial，this experiment cloned two genes，MCADandLCAD，of ACADs family from the liver tissue ofCyprinuscarpiousing classic RT-PCR.The open reading frames ofMCADandLCADwere 1 275，1 326 bp in length respectively，encoding 424 and 441 amino acids with characteristics of ACADs family structure (such as FAO binding sites，the substrate binding site and catalytic site)，sharing high homology with zebrafish，93.16% and 94.56% respectively.The results of RT-PCR showed thatMCADandLCADmainly expressed in the liver and heart. No significant influence was observed of different sources of fat on the expression ofMCAD，while fish oil could obviously stimulate the expression ofLCAD. After IPTG induction，both the two prokaryotic expression vectors，MCADs-pEASY(E2)，andLCADs-pEASY(E2)，expressed fusion proteins of 43.0，43.6 kDa in molecular weight，with obvious absorption peak at 370，450 nm，which was proved to be able to naturally bind to FAO cofactors. Phenazine methyl sulfate reaction method was applied to determine the enzyme activity of Prokaryotic expression protein，and the results indicated that the optimum temperature for MCAD and LCAD enzymes were 28 ℃，and the enzyme activity were 9.12，10.29 U/g respectively. This study preliminary confirmed thatMCADandLCADhad highly expression in liver and heart ofCyprinuscarpio，similar as in Mammals，and high unsaturated fatty acid could promote the expression ofLCAD.

Cyprinuscarpio；MCAD；LCAD； Clone； Prokaryotic expression；Enzyme activity

2017-03-10

中国水产科学研究院基本科研业务费专项课题(2016HY-ZD0303)；江苏省水产三新工程项目(Y2015-4)；中央级基本科研业务费项目(2015JBFM10)

喻文娟(1989-)，女，河南信阳人，在读硕士，主要从事遗传育种与分子生物学研究。

俞菊华(1966-)，女，江苏苏州人，研究员，博士，硕士生导师，主要从事遗传育种与分子生物学研究。

Q78

A

1000-7091(2017)03-0048-10

10.7668/hbnxb.2017.03.008