洋葱AcPME基因的克隆及序列分析

孙亚玲++陈立++孙雨晴++杨妍妍++吴雄++曹辰兴++霍雨猛

摘要：以洋葱花蕾为试材，通过RACE试验获得了AcPME基因的全长cDNA序列，GenBank登录号为JF913196.1。该基因DNA序列包含2 786个碱基，4个外显子，3个内含子，cDNA序列长度为2 228 bp，编码序列长度为2 001 bp，编码666个氨基酸。生物信息学分析显示AcPME蛋白存在明显的信号肽和跨膜区域（SP/TM）、PMEI结构域和PME结构域，在PME家族分类中属于第Ⅰ类，即含有一个长的N末端前区域（PRO-region）。氨基酸同源比对与系统进化分析表明，AcPME蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的同源蛋白具有较高的一致性。三维结构模式图显示该蛋白具有一个明显的凹沟，4个果胶结合位点氨基酸残基（T423、Q453、R565和W567），2个活性位点氨基酸残基（D476和D497）。本研究为洋葱AcPME基因的结构域蛋白互作及功能研究奠定了基础。

关键词：洋葱；果胶甲酯酶（PME）；克隆；序列分析

中图分类号：S633.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）06-0007-07

AbstractThe sequence of AcPME gene was obtained through rapid amplification of cDNA ends （RACE） based on the sample of onion flower bud. The GenBank accession number was JF913196.1. The AcPME genomic DNA consisted of 2 786 bases with 4 exons and 3 introns. The cDNA length was 2 228 bp with a 2 001 bp ORF and encoded 666 amino acids. The bioinformatic analysis showed that the AcPME protein consisted of a signal peptide and transmembrane domain （SP/TM）， a PMEI structural domain and a PME structural domain， which belonged to type I with a long N terminal PRO-region in the PME families. The amino acid homologous alignment and phylogenetic tree analysis exhibited that there were higher identities between AcPME and PME of homologous monocotyledons such as rice， maize and sorghum. The three-dimensional structure map showed AcPME protein had an obvious shallow cleft， 4 amino acid residues （T423， Q453， R565 and W567） binding to substrate and 2 residues （D476 and D497） involved in catalysis. The research laid a foundation for the biological functions of AcPME protein and the interactions between PMEI and PME domains.

KeywordsOnion； Pectin methylesterase （PME）； Cloning； Sequence analysis

果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）是催化果胶复合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸单元去甲酯化的一类细胞壁蛋白，根据其保守的结构域该酶组成了一个巨大的基因家族。在分类上依据其N端前区域的长短及有无，分为两种类型，Type Ⅰ和Type Ⅱ，它们在植物不同的生长发育阶段及不同生理过程中通过作用于细胞壁而发挥作用[1]。已有的研究发现，果胶甲酯酶参与了多种生理过程，如果实成熟、器官脱落、小孢子发育、花粉管伸长、种子萌发、抗病性、形成层细胞分化等[2-5]。

植物花粉管的发育是植物生殖发育的重要环节，花粉管壁和其他部位的细胞壁不同，由单层果胶组成，没有纤维素和胼胝质等成分，所以果胶甲酯酶基因在花粉和花粉管的生长发育中至关重要[6]。在拟南芥花药发育过程中，约有20 000个基因在花粉中表达，但其中仅有约10%的基因为花粉特异性表达[7]。迄今为止，研究者们已对油菜[8]、矮牵牛[9]、玉米[10]、紫花苜蓿[11，12]、亚麻[13]、烟草[14]、拟南芥[15]和白菜[16，17]等植物的花或花粉特异表达的PME基因进行了研究。

本课题组在研究洋葱育性相关基因差异表达的过程中，发现了一个大小约为350 bp的片段始终只在可育材料中出现[18]。我们回收测序此片段，并做序列比对结果显示，该基因片段编码蛋白具有果胶甲酯酶结构域，属于果胶甲酯酶超家族成员，该片段代码为AcPME3031（GenBank Accession GU384209）。本研究以洋葱AcPME基因部分片段GU384209为切入点，通过RACE试验获得AcPME基因的全长cDNA序列，以利对其进行后续的生物信息学分析研究。

1材料与方法

1.1试验材料

洋葱育性恢复系12-10（S， MsMs）花蕾采自山东省农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地，用液氮速冻后，储存于-80℃超低温冰箱中。