酶联免疫法（ELISA）测定月饼中黄曲霉毒素B1

朱 琳，章智华，谢凤英

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

酶联免疫法（ELISA）测定月饼中黄曲霉毒素B1

朱 琳，章智华，*谢凤英

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

采用酶联免疫法对月饼中黄曲霉毒素B1含量进行测定，并对该方法的线性、灵敏度、回收率和重现性进行验证；黄曲霉毒素B1标准品在1.00～50.00 g/kg范围内线性良好，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4，该方法对黄曲霉毒素B1的最低检出含量为1.00 g/kg，不同含量添加所得回收率为96.7%～105.0%，重复性好，精密度为1.96%。通过对9个不同产品特性月饼中黄曲霉毒素B1的测定，发现所有样品均有检出，但黄曲霉毒素B1的含量均小于5.00 g/kg。结果表明，酶联免疫检测方法测定快速、定量准确、重现性好，可高效率地定量检测大量市售月饼中黄曲霉毒素B1的含量。关键词：酶联免疫法（ELISA）；黄曲霉毒素B1；月饼

黄曲霉毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉、烟曲霉和少数温特霉菌株产生，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素衍生物。目前，分离鉴定出的天然黄曲霉素主要类型为B和G毒素，包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）和黄曲霉毒素G2（AFG2），其中以黄曲霉毒素B1毒性最强。1993年，国际癌症研究机构定义黄曲霉毒素B1为一类致癌物，其毒性相当于氰化钾的10倍、砒霜的68倍，尤其对人和动物肝脏具有极强致癌性[1]。毒理学研究表明，黄曲霉毒素的危害还包括导致机体免疫力低下、致畸和致突变性。根据GB 2761—2011食品国家标准食品中真菌毒素限量规定，稻谷、糙米、大米及其制品中黄曲霉毒素B1限量为10 g/kg，小麦、大麦、其他谷物及其制品的限量为5 g/kg，婴幼儿配方食品和辅助食品限量为0.5 g/kg。欧盟国家规定更为严格，要求加工谷类食品和婴儿食品中黄曲霉毒素B1的含量不能超过0.1 g/kg，因此及时检测黄曲霉毒素B1已成为世界各国都非常重视的问题。

目前，食品中应用比较广泛的黄曲霉毒素检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、酶联免疫测定法（ELISA）、液相色谱质谱串联分析技术（LC-MS/MS）等。HPLC和LC-MS/MS方法虽然定量准确，但是样品前处理一般需特定的净化柱，净化柱价格相对较高，同时需要配置价格昂贵的检测仪器，操作人员需专门经过仪器培训；而酶联免疫法（ELISA）只需要全扫描酶标仪，操作简单、快速、灵敏度高，检测人员容易上手，在许多企业和小型检测机构得到了广泛应用。月饼因含有大量油脂、糖分、蛋白质，黄曲霉毒素B1污染可能性较大[2]。由于月饼节令性较强，短时间内需完检，试验利用酶联免疫检测技术（ELISA）以月饼为样本，检测了当地市场中随机抽取月饼中黄曲霉毒素B1的含量，并对检测方法进行有效评估[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

月饼，随机购于广东省某超市，品种包括五仁、蛋黄莲蓉、水果、火腿4种口味，各8批次共32批次；甲醇、三氯甲烷、无水硫酸钠，均为分析纯。

1.2 仪器

Thermo multiskan MK3型酶标仪，美国热电公司产品；HY-5型水浴恒温回旋振荡器，国华电器有限公司产品；恒温干燥箱，德国BINDER公司产品；黄曲霉毒素B1检测试剂盒，德国R-Biopharm拜发有限公司产品。

1.3 方法与步骤

1.3.1 样品前处理方法

参照国标（GB/T5009.22—2003），准确称取20.0 g粉碎样品于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL的甲醇-水（55∶45）提取液和30 mL正己烷，振荡30 min，过滤于125 mL分液漏斗中，静置分层，取下层清液于烧杯中，准确量取20 mL三氯甲烷，加塞振荡2 min，静置分层，经盛有约10 g预先用三氯甲烷润湿的无水NaSO4定量快速滤纸过滤于蒸发皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，将三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量的三氯甲烷洗涤无水Na2SO4过滤器，洗液滤于蒸发皿中，将蒸发皿放入通风橱于65℃水浴挥干，用10 mL甲醇-PBS（2∶8）将凝结物分3次溶解，制作样品提取液。

1.3.2 检测步骤

将测试盒放置于室温中30 min，平衡至室温25℃；准确加入1.5 mL酶标抗原稀释液，充分溶解，稀释为试验用酶标抗原溶液，于2～8℃下保存；取适量浓缩洗涤液，用蒸馏水稀释20倍，作为试验用洗涤液。酶联免疫试验详细步骤如下：①根据待测样品量，截取相应酶标板孔数，每孔加入250 L洗涤液洗涤，放置1 min后甩掉洗涤液，在吸水纸上排干，重复洗板1次。②依次加入配置好的标准溶液和月饼样品提取液50 L，除仪器调零孔加入50 L酶标抗原稀释液外，其余各孔均加入50 L酶标抗原溶液。③将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30 min。④取出反应板，用力甩掉反应液，拍干后，每孔加入250 L洗涤液洗涤，重复洗板4次。⑤每孔加入显色底物液A和B，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15 min。⑥显色结束后，每孔加入50 L终止液，摇匀后用酶标仪于波长450 nm处测定各孔的吸光度。

1.3.3 方法评价

从方法的线性、回收率、灵敏度、重现性4个方面，对月饼中黄曲霉毒素B1的酶联免疫法进行方法评价。

1.3.4 结果计算

样品中黄曲霉毒素B1含量按式（1）计算：

式中：W——试样中黄曲霉毒素B1含量，g/kg；

C——样品液中黄曲霉毒素B1含量，g/kg；

V——样品定容体积，mL；

m——样品质量，g；

D——稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法筛选

对于月饼的前处理方法，试验测试了2种提取溶剂，一种是以甲醇为提取溶剂，分别设置甲醇与水的体积比为1∶1和7∶3；另一种是三氯甲烷。通过比较，用三氯甲烷作为提取溶剂，回收率达标，本底值偏低，对试验结果干扰小，最后选定三氯甲烷作为提取溶剂。

2.2 线性

将系列黄曲霉毒素B1标准溶液（0，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 g/L）测得的吸光度，绘制标准曲线，横坐标为标准曲线质量浓度的常用对数值（lgC），纵坐标为各标准液吸光度与0 ng/mL标准溶液孔吸光度的比值，得线性方程Y=-40.291C+88.365，黄曲霉毒素B1在0～50.00 μg/L范围内呈线性相关。

黄曲霉毒素B1标准曲线见图1。

图1 黄曲霉毒素B1标准曲线

2.3 灵敏度测定

按照试验步骤，通过依次添加黄曲霉毒素B1到样品中，降低黄曲霉毒素B1于波长450 nm处的光密度来确定最低检测浓度，即检测的灵敏度。

黄曲霉毒素B1灵敏度试验见表1。

由表1可知，黄曲霉毒素B1含量为1.00 g/kg时，酶标仪于波长450 nm处的吸光度为1.812。与黄曲霉毒素B1为0时的吸光度1.714之差大于0.1，此值可确定为此方法的灵敏度，由于对黄曲霉毒素B1的最低检出量为1.00 g/kg，因此将月饼黄曲霉毒素B1的检测灵敏度确定为1.00 g/kg。

2.4 回收率

选2#月饼样品作为添加回收试验样品，分别添加0，1.5，3.0，5.0 g/kg，按照试验步骤测定添加样品中黄曲霉毒素B1含量，每个样品做3个重复，样品的加标回收率在95%左右。

黄曲霉毒素B1回收率试验见表2。

表1 黄曲霉毒素B1灵敏度试验

表2 黄曲霉毒素B1回收率试验

2.5 重现性

按照试验检测步骤重复测定月饼中黄曲霉毒素B1的含量6次，计算其标准差和相对标准偏差。

黄曲霉毒素B1重现性试验见表3。

表3 黄曲霉毒素B1重现性试验

由表3可知，多次样品测定的平均值为1.441，标准差为0.03%，相对标准偏差为1.96%，重现性能够满足分析方法的要求。

2.6 不同品种月饼中黄曲霉毒素B1的含量

选取目前市场上消费较多的五仁、蛋黄莲蓉、水果、火腿4类月饼样品，样品编号1～9测定黄曲霉毒素B1的含量。

月饼中黄曲霉毒素B1含量的测定见表4。

表4 月饼中黄曲霉毒素B1含量的测定

由表4可知，9个随机购买的月饼样品中均检出黄曲霉毒素B1[4]，其中3个样品黄曲霉毒素B1含量小于0.5 g/kg，4个样品黄曲霉毒素B1含量为0.5～1.0 g/kg，2个样品黄曲霉毒素B1含量大于1.0 g/kg且小于2.0 g/kg。总体来看，随机购买的月饼样品中黄曲霉毒素B1含量低。参考食品中真菌毒素限量标准（GB 2761—2011），抽取的9个月饼样品中黄曲霉毒素B1含量均未超标。

3 结论

在测定的9个月饼样品中，虽然黄曲霉毒素B1含量没有超出标准，但是检出率达100%，由此观之，月饼作为一种受欢迎的食品，存在一定的食品安全风险。月饼因含有大量油脂、糖分、蛋白质，黄曲霉毒素B1污染可能性较大。

[1]Liu S W，Bai F，Li，et al.Investigation on AFB1toxin contamination in the pig feed in Southwest China[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine，2016，48（3）：51-54.

[2]管笛，亢子佳，贾迪，等.磁性酶联免疫吸附法检测玉米中黄曲霉毒素B1[J].食品研究与开发，2016，37（5）：101-105.

[3]吉小凤，陈笑芸，魏巍.酶联免疫法（ELISA）测定瓶装黄酒中黄曲霉毒素B1[J].浙江农业学报，2015，27（11）：2 006-2 010.

[4]邱杨，刘建丽，赵丽.食品中黄曲霉毒素B1的抽查检验与安全评价[J].现代食品科技，2008，24（10）：1 055-1 057.◇

Determination of Aflatoxin B1in Chinese Moon Cake by Enzyme-linked Immunosorbant Assay（ELISA）

ZHU Lin，ZHANG Zhihua，*XIE Fengying
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

The content of aflatoxin B1in the moon cakes is measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The linearity，sensitivity，recovery and reproducibility of the method are verified.The linear range of aflatoxin B1standard is 1.00～50.00 μg/kg，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4.The lowest detectable concentration of aflatoxin B1is 1.00 μg/kg.The recoveries are 96.7%～105.0%with good reproducibility and precision of 1.96%.The results of aflatoxin B1detection show that the contents of aflatoxin B1are less than 5.00 g/kg.The results of enzyme-linked immunosorbent assay show that the method is simple，determination of fast quantitative and accurate，reproducible，and can be highly effective quantitative detection of large quantities of commercially available moon cake in the aflatoxin B1content.

enzyme-linked immunosorbant assay（ELISA）；aflatoxin B1；Chinese moon cake

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.044

1671-9646（2017）05b-0056-03

2017-04-26

朱琳（1997—），女，本科，研究方向为食品科学。

*通讯作者：谢凤英（1975—），女，博士，讲师，研究方向为粮食、油脂、植物蛋白质工程。