菝葜治疗两种不孕症大鼠模型疗效观察及初步机制研究

徐 缨金晓飞蒋 旭

菝葜治疗两种不孕症大鼠模型疗效观察及初步机制研究

徐 缨1金晓飞2蒋 旭2

目的研究菝葜治疗排卵障碍型不孕症和输卵管炎性不孕症大鼠模型的疗效及其初步机制。方法Sprague Dawley大鼠70只，采用雄激素致排卵障碍型不孕症大鼠模型，采用苯酚胶浆法致输卵管炎性不孕症大鼠模型，分别设立菝葜组、对照组、模型组和正常组。排卵障碍型不孕症大鼠菝葜组和对照组分别灌胃菝葜提取物12g/（kg·d）、枸橼酸克罗米芬4.5mg/（kg·d），模型组和正常组均灌胃蒸馏水12mg/（kg·d）。输卵管炎性不孕症大鼠除对照组灌胃妇科千金片3.0g/（kg·d），余三组同排卵障碍性不孕症。对排卵障碍型不孕症大鼠检测体质量差、子宫指数、卵巢指数、血清雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）；对输卵管炎性不孕症大鼠进行炎症评分，检测血清肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）。结果排卵障碍型不孕症大鼠菝葜组体质量差比对照组和模型组明显减轻[（37.00±4.78）g比（44.37±2.26）g、（45.12±2.29）g，P<0.01]，卵巢指数比模型组偏高[（32.51±1.51）比（30.37±1.40），P<0.05]，子宫指数与模型组无差异（P>0.05），血清E2、LH、FSH浓度比正常组和对照组均低，但比模型组明显偏高[E2：（619.75±25.40）pg/mL比（959.25± 15.14）pg/mL、（781.00±42.69）pg/mL、（572.37±3.15）pg/mL；LH：（5.10±0.19）mIU/mL比（5.27±0.12）mIU/mL、（6.10±0.19）mIU/mL、（4.32±0.15）mIU/mL；FSH：（0.98±0.16）mIU/mL比（1.37±0.04）mIU/mL、（1.31±0.04）mIU/mL、（0.66±0.07）mIU/mL；P<0.05或P<0.01]。输卵管炎性不孕症大鼠菝葜组炎症评分比模型组明显降低[（1.71±0.35）分比（3.28±0.77）分，P<0.01]，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），血清TNF-α和IL-2与模型组比较差异均有统计学意义[TNF-α：（0.46±0.04）ng/mL比（1.13±0.22）ng/mL；IL-2：（1.70±0.01）ng/mL比（1.00±0.17）ng/mL；P<0.01]，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论菝葜对雄激素致排卵障碍型不孕症大鼠模型的体质量有较好的干预作用，对卵巢指数的增加有一定的帮助，对血清E2、LH、FSH有一定的良性调节；菝葜对输卵管炎性不孕症大鼠模型的炎症评分有明显改善，对血清TNF-α和IL-2具有很好的调节作用。

大鼠；不孕症；菝葜；TNF-α；IL-2；生殖激素

菝葜为百合科植物菝葜（smilax china L.）的干燥根茎，《名医别录》中列菝葜为中品，味甘、微苦、涩，性平，归肝、肾经。具有利湿祛浊、祛风除痹，解毒散瘀之功效[1-2]。菝葜广泛用于治疗妇科疾病，对妇科炎症和不孕症具有较好的功效。本实验拟通过菝葜治疗无排卵型大鼠模型和输卵管炎症大鼠模型，研究菝葜治疗两种类型不孕症的疗效及其初步作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物选用SPF级健康雌性Sprague Dawley大鼠70只，22日龄，体质量（180±20）克，由浙江中医药大学实验动物中心提供和饲养，合格证号：SYXK（浙）2013-0184。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料（由实验动物中心提供）及自由饮水，12h循环灯光。

1.2 主要试剂与药品菝葜，杭州华东医药参茸分公司；生理盐水，无锡市晶科化学工业有限公司；75%医用酒精、碘伏，杭州欧拓普生物技术有限公司；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司；缝合线，杭州华威医疗用品有限公司；甲醇、异丙醇，无锡市晶科化学工业有限公司；20%苯酚糊剂，用1% CMC-Na作溶剂，自行配制，使用时摇匀；白细胞介素-2（IL-2）放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司；碘[123]肿瘤坏死因子（TNF-α）放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司；血清雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）放射免疫分析试剂盒，北京北方生物技术研究所；枸椽酸克罗米芬片（50mg/片），塞浦路斯高特制药有限公司；丙酸睾丸酮注射液（lmL∶25mg），上海通用药业有限公司；中性茶油（500g/瓶），浙江田雨山药用油有限公司；妇科千金片，3.4g生药/片，湖南株洲千金药业有限公司。

1.3 主要仪器设备隔水式恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；恒温手术台，Harvard公司；ACSD型电子计价秤，浙江永康市整雅衡量一厂；AB135-S电子天平，法国METTLE TOLEDO公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；M4酶标仪，MD公司；电泳-转印系统，美国Bio-Rad公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；TGL-1G型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产；DDL-5低速离心机，上海安亭科学仪器厂生产；SN-695B型智能放免测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂生产；光学显微镜，OLYMPUS8122214，日本。

2 实验方法

2.1 大鼠模型的制备雄激素致排卵障碍型不孕症大鼠模型的制作参照魏美娟等实验方法[3]。选择22日龄SD雌性大鼠幼鼠，于颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25mg/只（0.05mL/只），正常组在相同部位皮下注射等量中性茶油0.05mL。至70日龄阴道开口之后，每日取阴道脱落细胞涂片，镜下观察，连续观察10天（1个性周期为5天），涂片出现持续性无核角化细胞，提示无性周期变化，造模成功。

输卵管炎性不孕症大鼠模型采用“苯酚胶浆法”[4]。将大鼠麻醉、固定、局部脱毛消毒后，在腹正中行0.8～1cm长的纵向切口，暴露并固定子宫，用4号针头在“Y”型子宫分叉处左侧进针，向卵巢方向缓慢注入20%苯酚胶浆0.1mL，正常组（假手术组）注射同等剂量的生理盐水，出针时按压针孔以防渗漏；注毕，分层关腹，于缝合伤口上涂抹2%碘酊并撒适量青霉素－钠（PG-Na）粉末以防感染。造模15天后随机抽取其中3只解剖，大体观察见子宫组织与盆腔其它组织有粘连，宫腔部分狭窄、子宫壁充血；取子宫组织做病理切片，光镜下观察见子宫内膜上皮及腺上皮细胞增生，大量淋巴细胞、浆细胞浸润，尚可见少量中性粒细胞，证明造模成功[5-6]。

2.2 分组及给药排卵障碍型不孕症大鼠模型随机分为3组，每组8只：菝葜组采用菝葜提取物12g/（kg·d）灌胃，对照组采用枸橼酸克罗米芬4.5mg/（kg· d）灌胃，模型组给予蒸馏水12mg/（kg·d）灌胃；正常组8只，灌胃同模型组。输卵管炎性不孕症大鼠模型随机分为3组，每组8只：菝葜组采用菝葜提取物12g/（kg·d）灌胃治疗，对照组采用妇科千金片3.0g/（kg·d）灌胃治疗，模型组给予蒸馏水12mg/（kg·d）灌胃；正常组（假手术组）8只，灌胃同模型组。自80日龄起开始每日灌胃给药。菝葜70%乙醇提取物按照相关文献报道制备[7-8]，临床给药以60kg/人为标准，按照（体表面积-剂量）换算法（大鼠用量=成人日服用量×0.018×5）计算大鼠给药剂量。菝葜提取物用蒸馏水配成浓度为4g/mL的混悬液。妇科千金片悬液，配药浓度10%。每天同一时间灌胃，均连续灌胃4周后检测指标。

2.3 标本采集及指标检测排卵障碍型不孕症大鼠模型：（1）在给药第4周起每日上午定时用消毒棉签取大鼠阴道脱落细胞做涂片，连续一个性周期，显微镜下观察大鼠阴道脱落细胞涂片，观察大鼠出现动情周期变化的例数，对排卵率的影响。（2）最后一次灌胃后24h称重，所得体质量值减去治疗前体质量值即为体质量差。（3）称重后，用戊巴比妥钠(浓度为3%)腹腔注射麻醉大鼠，用5mL一次性注射器抽取腹主静脉血4mL，置事先预备的塑料试管中，4℃存放4h后，3000rpm、4℃离心15min，取上清液，分装置4℃保存备用。放射免疫法测定大鼠血清雌二醇、促黄体生成素、卵泡刺激素浓度。（4）取大鼠子宫和卵巢称重后，计算每只大鼠的子宫指数（mg/100g）及卵巢指数（mg/100g）。

输卵管炎性不孕症大鼠模型：（1）肉眼观察左侧大鼠子宫的大体形态变化，并与右侧子宫进行对比，具体观察以下几个方面：子宫与周围组织的粘连、子宫壁充血、宫腔狭窄、宫腔积液、炎性包块、对右侧子宫的影响。将6个项目的情况由轻到重评分为0、1、2、3分，统计炎症积分并进行比较[9]。（2）放射免疫法测定大鼠血清TNF-α和IL-2浓度。

2.4 统计学方法应用SPSS17.0软件，服从近似正态分布的计量资料用均数±标准差表示，多组间比较用一维方差分析（F检验），方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验；均以P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

实验过程中由于苯酚胶浆法造模后死亡2只，术后随机抽取3只大鼠处死用于判断造模是否成功。正常饲养至80日龄后，连续灌胃4周，治疗结束后每组各取8只大鼠进行指标检测。

3.1 菝葜对雄激素致排卵障碍型不孕症大鼠模型的影响治疗结束后，各组与正常组相比，体质量均有明显增加（P<0.01）；菝葜组比对照组和模型组明显减轻（P<0.01）。对照组子宫指数和卵巢指数较模型组明显增加（P<0.01），菝葜组卵巢指数比模型组偏高（P<0.05）；各组与正常组相比，两项指数均明显降低（P<0.01）。与模型组相比，各组血清雌二醇、促黄体生成素、卵泡刺激素浓度均有明显升高（P<0.01），与正常组比较均明显降低（P<0.05，P<0.01），菝葜组三项指标均低于对照组（P<0.01），见表1。

表1 各组排卵障碍型不孕症大鼠体质量差、子宫指数、卵巢指数及生殖激素比较

表1 各组排卵障碍型不孕症大鼠体质量差、子宫指数、卵巢指数及生殖激素比较

注：与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与正常组比较，＃P<0.05，＃＃P<0.01；与菝葜组比较，*P<0.05，**P<0.01；E2：雌二醇，LH：黄体生成素，FSH：卵泡刺激素

?

3.2 菝葜对输卵管炎性不孕症大鼠模型的影响治疗后，菝葜组和对照组炎症评分均比模型组明显降低（P<0.01），对照组与菝葜组相比差异无统计学意义（P>0.05）。各组TNF-α与模型组相比均明显降低（P<0.01），菝葜组、对照组、正常组相比差异无统计学（P>0.05）。各组IL-2比模型组明显偏高，与正常组相比均明显偏低（P<0.01），菝葜组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 各组输卵管炎性不孕症大鼠炎症指标比较

表2 各组输卵管炎性不孕症大鼠炎症指标比较

注：与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与正常组比较，＃P<0.05，＃＃P< 0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子；IL-2：白细胞介素-2

?

4 讨论

排卵障碍和输卵管炎症是导致不孕症的最常见病因，两者常兼具[10]。菝葜为民间常用中药，能祛风湿、利小便、消肿毒，可治关节痛、水肿、疔疮等，还对妇科附件炎、附件炎性包块等有较好疗效，民间将菝葜单味药用于治疗不孕症，收效较好[11-12]。菝葜的有效成分可以降低大鼠子宫的肿胀率，调节大鼠子宫组织中的TNF-α和IL-4等炎症因子的表达[13-14]。目前，对于中药治疗无排卵性不孕症的研究中，关注较多的是补肾调经中药或方剂，尚未见菝葜治疗无排卵性不孕的研究报道[15]。

本试验采用雄激素致不孕大鼠（androgen－induced sterile rats,ASR）作为无排卵性不孕症的动物模型，是目前比较明确的动物模型类型[16]。对于输卵管炎性不孕症的模型采用“苯酚胶浆法”，是比较成熟的慢性盆腔炎大鼠造模方法，该模型造成的组织增生、炎性粘连、局部狭窄、积液、慢性炎症细胞浸润等病理改变，与人类慢性盆腔炎表现出的病理变化极为相似[17]。本试验对单味药菝葜提取物治疗两种类型的不孕症同时进行研究，旨在探索菝葜治疗不孕症的初步机理，在目前已知该药具有抗炎止痛功效的基础上，观察其对下丘脑－垂体－卵巢性腺轴的调节作用。

本研究结果提示，菝葜对雄激素致无排卵大鼠模型的体质量有较好的干预作用，对增加大鼠模型的卵巢指数有一定的帮助，对E2、LH、FSH三项生殖激素有一定的良性调节，优于模型组，但疗效不如对照组。菝葜对输卵管炎性不孕症大鼠模型的炎症评分有明显改善，对TNF-α和IL-2两项炎症因子都具有良性调节作用。以上实验研究结果表明，菝葜提取物对苯酚胶浆导致的大鼠输卵管慢性炎症有比较明确的疗效，对雄激素致无排卵大鼠模型的体质量和生殖激素有一定的干预作用。基于以上的研究结果，对于输卵管炎性不孕症或炎性不孕症合并有排卵障碍的患者，菝葜可以作为主要的用药，对于排卵功能障碍合并体质量超重的不孕症，菝葜亦可作为辅助用药。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］．北京：中国医药科技出版社，2010：290．

［2］钱芳芳，张长林.菝葜化学成分与药理作用的研究进展［J］.药学研究，2013，32（4）：229-231.

［3］魏美娟，俞瑾.补肾药对雄激素致无排卵大鼠垂体及卵巢的形态学变化观察［J］.中国中西医结合杂志，1993，13（3）：164-166.

［4］陈学忠.活血化瘀方防治子宫内膜粘连的实验研究［J］.中西医结合杂志，1986，6（1）：740.

［5］蔡雪芬，王樟连，陈利芳.黄芪注射液穴位注射治疗慢性盆腔炎的实验研究［J］.浙江大学学报（医学版），2006，35（4）：430-434.

［6］陈利芳，蔡雪芬，王樟连.黄芪注射液穴位注射对慢性盆腔炎大鼠SIgA及细胞因子的影响［J］.中华中医药学刊，2007，25（11）：2321-2324.

［7］罗艳琴，马云，宋路瑶，等.菝葜不同浓度乙醇提取物的抗炎活性筛选［J］.医药导报，2014，33（7）：858-862.

［8］林钰文，赖琼，高妮，等.正交试验优选菝葜提取工艺［J］.食品与药品，2015，17（4）：240-243.

［9］Peeling RW，PattonDL，Cosgrove Sweeney YT，et al.Antibody response to the chlamydial heat-shock protein 60 in an experimental model of chronic pelvic inflammatory disease in monkeys（Macacanemestrina）［J］.J Infect Dis，1999，180（3）：774-779.

［10］黄杭珍.不孕症流行现状与趋势探讨［J］.中医药管理杂志，2006，24（3）：11-12.

［11］刘卫东，付庆霞.金刚藤现代研究概述［J］.中外医学研究，2012，10（5）：155-156.

［12］王秀红，徐丽.金刚藤胶囊治疗炎性不孕症效果观察［J］.中国社区医师，2009（13）：38.

［13］罗艳琴，马云，宋路瑶，等.菝葜活性成份对慢性盆腔炎大鼠子宫组织肿瘤坏死因子-ɑ和白介素-4的影响［J］.南方医科大学学报，2014，34（2）：236-240.

［14］吴大章，苏泰安，代华均，等.金刚藤多糖对大鼠慢性盆腔炎的治疗作用及对血清免疫球［15］崔火仙.补肾促孕汤治疗黄体功能不健不孕症的临床观察［J］.浙江中医杂志，2013，48（6）：395-396.

［16］徐丁洁，洪丽文，徐洪，等.补肾调经方、逍遥丸对雄激素致排卵障碍模型大鼠腺垂体、卵巢影响的比较研究［J］.中国中西医结合杂志，2014，34（1）：87-90.

［17］李钦，李晓丽，赵吟，等.盆炎坤和汤对苯酚胶浆致慢性盆腔炎大鼠模型的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2014，19（4）：5-7.

（收稿：2016-11-10修回：2016-12-09）

Effects of Chinaroot Greenbrier on Two Kinds of Infertility Rat Models and the Preliminary Mechanism

XU Ying1,JIN Xiaofei2,JIANG Xu2.1 Department of Internal Chinese Medicine,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 The Third Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo study the effects of Chinaroot greenbrier on infertility rats with ovulation obstacleorchronic pelvic inflammatory disease（CPID）and to probe the preliminary mechanism.MethodsExperiment one applied the androgen-anovulatory rat model,experiment two used the CPID rat model caused by phenol mucilage. Each experiment was divided into four groups:treatment group,control group,model group and normal group. Treatment group and control group in experiment one were intragastrically given the extract from Chinaroot greenbrier of 12g/（kg·d）and serophene of 4.5mg/（kg·d）,model group and normal group were given distilled water 12mg/（kg·d）.In experiment two,control group was given Fukeqianjinpian of 3.0g/（kg·d）,the rest groups were administered the same drugs as in experiment one.Experiment one tested the weight changes,the indexes of uterus and ovarian,serum estradiol（E2）,luteinizing hormone（LH）and follicle-stimulating hormone（FSH）;Experiment twoevaluated the inflammatory score of CPID,serum tumor necrosis factor（TNF-α）and interleukin-2（IL-2）.ResultsExperiment one:in treatment group,the weight of rats was significantly reduced than that incontrol group and in model group（37.00±4.78g vs 44.37±2.26g,45.12±2.29g,P<0.01）,the ovarian index was higher than that of model group（32.51±1.51 vs 30.37±1.40,P<0.05）,the uterus index had no difference compared to the model group（P> 0.05）,the concentration of serum E2，LH and FSH were lower than that ofnormal group and control group but higher than that of model group（E2：619.75±25.40pg/mL vs 959.25±15.14pg/mL,781.00±42.69pg/mL,572.37±3.15pg/ mL;LH:5.10±0.19mIU/mL vs 5.27±0.12mIU/mL,6.10±0.19mIU/mL,4.32±0.15mIU/mL;FSH:0.98±0.16mIU/mL vs 1.37±0.04mIU/mL,1.31±0.04mIU/mL,0.66±0.07mIU/mL;P<0.05 or P<0.01）.Experiment two:the inflammation score of treatment group was significantly decreased than that of model group（1.71±0.35 vs 3.28±0.7,P<0.01）,but had no significant difference compared with that of control group（P>0.05）;the concentration of serum TNF-α was significantly lower and IL-2 washigher that those of model group（TNF-α:0.46±0.04ng/mL vs 1.13±0.22ng/mL;IL-2: 1.70±0.01ng/mL vs 1.00±0.17ng/mL;P<0.01）,but had no significant difference compared with that of control group（P>0.05）.ConclusionFor the androgen anovulatory rats model,chinaroot greenbrier has positive effects for weight changes,ovarian index,and adjustment of the serum E2,FSH,and LH.For the CPID model rats,chinaroot greenbrier can improve the inflammatory score,and have positive regulatory effect on the serum TNF-α and IL-2.

rats;infertility;Chinaroot greenbrier;TNF-α;IL-2;reproductive hormone

浙江省中医药科技计划项目（No.2014ZB058）

1浙江中医药大学附属第三医院中医内科（杭州310005）；2浙江中医药大学第三临床医学院（杭州310053）

徐缨，Email：xy_qy@126.com