离子液体对蛋白酶羊毛防毡缩整理效果的影响

单思佳，沈加加，张焕侠

(嘉兴学院材料与纺织工程学院，浙江嘉兴 314000)



离子液体对蛋白酶羊毛防毡缩整理效果的影响

单思佳，沈加加，张焕侠

(嘉兴学院材料与纺织工程学院，浙江嘉兴 314000)

基于离子液体对羊毛的溶胀性能和蛋白酶的催化性能，本文将离子液体应用于蛋白酶的防毡缩整理，用于获得更高效的防毡缩整理方法。先研究了三种离子液体(HEMIM-[N(SO2CF3)2]，[Emim]Br和[Emim]Ac)对SAV蛋白酶催化性能的影响。结果表明：在45℃长时间保温的条件下，[Emim]Br和[Emim]Ac有利于促进SAV蛋白酶的活性和热稳定性，其中[Emim]Br能使SAV蛋白酶的活性提高25%。最后将催化效果最好的[Emim]Br作为SAV蛋白酶整理的催化剂，研究其对防毡缩整理效果的影响，实验表明离子液体对SAV蛋白酶羊毛防毡缩整理具有催化效果，是酶处理羊毛防毡缩整理中较为理想的反应介质。

防毡缩 SAV蛋白酶 离子液体 酶活 催化

0 前言

工业上广泛应用的羊毛防毡缩方法是氯化赫克塞特整理(Chlorine-Hercosett)，虽然具有优异的防毡缩效果，但废水排放中会产生有机氯(AOX)污染，不符合目前的环保要求[1-2]。因此，无氯防毡缩技术一直是研究的主要方向，其中，生物酶具有绿色催化特性，被认为是最有潜力的替代氯化法的一种新型方法，但由于羊毛纤维表面被高度交联的鳞片角质层覆盖，导致蛋白酶分子对羊毛鳞片的实际水解效率较低[3-4]。仅用蛋白酶处理羊毛时，很难引起羊毛鳞片层的有效降解，所以蛋白酶与其他反应介质协同作用对羊毛防毡缩整理的研究受到广泛关注[5]。

随着科技的不断发展，离子液体(ionic liquid)受到了越来越多的关注。离子液体是由有机阳离子和无机/有机阴离子构成的，在室温或者室温附近温度下成液体状态的盐类[6-8]。与普通有机溶剂相比，离子液体具有以下优点：(1)种类繁多，可选择性高；(2)不易挥发，在常温下无色、无味、无毒，对环境友好，使用安全；(3)具有可设计性，可根据其对物质的溶解性需要更改阴阳离子的组合[9]；(4)不易分解，化学稳定性较好；(5)与部分有机溶剂互不相溶，能使催化产物易于提纯并容易分离；(6)酶在离子液体中会具有更高的化学、区域和立体选择性[10]。

基于离子液体对羊毛的溶胀性能和蛋白酶的催化性能，本文将离子液体应用于蛋白酶的防毡缩整理，用于获得更高效的防毡缩整理方法。

1 试验部分

1.1 材料和仪器

材料：澳毛(70S，浙江新澳毛纺股份有限公司)；SAV蛋白酶(8.0T，诺维信公司)

试剂：磷酸二氢钠(分析纯)；磷酸氢二钠(分析纯)；无水碳酸钠(分析纯)；冰醋酸(分析纯)；福林试剂(国药集团化学试剂有限公司)；三氯醋酸(分析纯)；浓盐酸(盐酸浓度为37%)；氢氧化钠(分析纯)；溴化1-乙基-3-甲基咪唑[Emim]Br，1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐[Emim]Ac，1-羟乙基-3-甲基咪唑双三氟甲烷磺酰亚胺盐HEMIM-[N(SO2CF3)2](上海成捷化学有限公司，纯度均为99%)。

1.2 羊毛防毡缩整理工艺

SAV蛋白酶整理：羊毛1g，Savinase酶用量4%(o.w.f)，浴比1：30，处理时间60min/120min，pH=8，温度为45℃。

离子液体处理(含0.2mol/L离子液体的磷酸缓冲液，pH=8，浴比1：30)

联合处理：先在含有离子液体的8%的缓冲液中处理10分钟，再加入8%蛋白酶处理50min。

酶失活：在温度为80oC的高温水浴中处理10min，使SAV蛋白酶失活。

对上述各方法处理后的样品分别记为：IL(单独离子液体处理样)、Ps(单独蛋白酶处理样)、IL+Ps(离子液体与蛋白酶联合处理样)。

性能测试：50-60oC温度下烘干，在温度20±3oC、相对湿度(65±5)%条件下平衡24h后用于性能测试。

1.3 离子液体对蛋白酶活性和热稳定性的影响

1.3.1 蛋白酶活性测定

取1ml浓度为2mg/mL的SAV蛋白酶酶液和1ml的1% 酪蛋白溶液加入到3ml不含离子液体的磷酸缓冲液和3ml其他三种含0.2mol/L离子液体的磷酸缓冲液中，在40oC保温15min，终止反应，加入福林试剂，在40oC下保温15min后用分光光度计测定其在680nm处的吸光度，并按照公式1换算为酶活[11-13]。

1.3.2 蛋白酶热稳定性测定

在100 mL具塞三角瓶中分别加入25 mL不含离子液体的磷酸缓冲液和含0.2 mol/L离子液体的磷酸缓冲液和25mgSAV蛋白酶(蛋白酶液浓度为1mg/mL)，分别于35℃、40℃、45℃、50℃和60℃下保温，定时取1mL酶液按照福林法测定此时SAV蛋白酶在40oC的吸光度，并按照公式1-1换算为酶活[14-16]。

本实验中SAV蛋白酶活力单位的计算：

每克SAV蛋白酶的活力单位=m / t×f1×f2……

式中：m——样品所测定的吸光度经查标准曲线求得的酪氨酸量(μg)；

t——酶促反应的时间(min)；

f1——酶的稀释倍数；

f2——福林法测酶活时酶液的稀释倍数[17-18]。

注：1gSAV蛋白酶在pH=8.0，40oC条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1μg酪氨酸定为一个酶活力单位。

1.4 离子液体-SAV蛋白酶整理对羊毛表面鳞片层的影响

利用扫描电镜观察处理后的羊毛表面鳞片层的变化，以分析不同工艺防毡缩处理的效果。

1.5 不同催化工艺对羊毛性能的影响

1.5.1 单纤维强力测试

根据GB4711-84《羊毛单纤维断裂强力和伸长试验方法》，用LLY-06A型电子单纤维强力仪测试断裂强力，试样夹距为10mm，拉伸速度设置10 mm/min，每个试样测定30个数据，求平均值。

1.5.2 毡缩球体积测试

先按照IWTO-20-04《散毛和毛条防毡缩性能的测试方法标准》制备好的0.4g球状羊毛试样。然后放入不锈钢容器中，倒入50mL洗涤溶液，旋紧不锈钢容器的盖子，将其放在红外染色机上，在40oC水浴中运30min。最后取出试样用烘箱烘干(温度105oC，时间2h)，观察其椭圆形状的大小并记录数据。

2 结果与讨论

2.1 离子液体对蛋白酶活性和热稳定性的影响

按1.2的方法计算酶活力大小，得到不同实验条件下酶活力如表1所示。

表1 不同实验条件下酶活力

从表1可以看出不同离子液体对SAV蛋白酶的活性都有一定的影响。HEMIM-[N(SO2CF3)2]使SAV蛋白酶的活性降低了29%，[Emim]Br使SAV蛋白酶的活性提高了25%，[Emim]Ac使SAV蛋白酶的活性提高了18%。

按1.2的方法计算酶活大小，得到不同实验条件下的蛋白酶的残余活性如图1所示。

(a)无离子液体对SAV蛋白酶活性的影响

(b)HEMIM-[N(SO2CF3)2]对SAV蛋白酶活性的影响

(c)不同温度下[Emim]Br对SAV蛋白酶活性的影响

(d)不同温度下[Emim]Ac对SAV蛋白酶活性的影响

以残余活性A(该条件下酶活力与酶原始活力之比)，对时间t/h用软件Origin7.5作图，酶的失活过程可以看作是两步失活动力学过程，用Marquardt Levenberg双指数四参数模型A=α1exp (k1t) +α2exp (k2t)进行拟合可得到失活速率常数k1和k2，因为k2的数值较小并低于k11～2个数量级且大部分情况为0，可以忽略k2求出半衰期t1/2。将图2-a的数据进行拟合，可以算出SAV蛋白酶在不同温度下的半衰期，从而得到其在不同温度下的热稳定性，如表2所示。

表2 不同温度下SAV蛋白酶的半衰期

注：HEMIM-[N(SO2CF3)2]中SAV蛋白酶酶在60oC中保温5分钟就失去近90%活性，该温度下半衰期小于5分钟。

由表2可以得出：

(1)温度越高，HEMIM-[N(SO2CF3)2]中SAV蛋白酶的半衰期越短，即[Emim]TF2N会使SAV蛋白酶热稳定性变差。在35℃、40℃、45℃和50℃的条件下，HEMIM-[N(SO2CF3)2]使SAV蛋白酶半衰期分别降低了51%，54%，67%，79%，在60 ℃的条件下，HEMIM-[N(SO2CF3)2]使SAV蛋白酶极其容易失活。

(2)在35℃、40℃、50℃和60℃的条件下，[Emim]Br均使SAV蛋白酶的半衰期分别降低了42%，18%，2%，46%；但是在45℃的条件下，[Emim]Br使SAV蛋白酶的半衰期增加了34%。由此可以得出，45℃是[Emim]Br对SAV蛋白酶进行处理的适宜温度，并且45℃时SAV蛋白酶的活性也较高。即在45℃时，[Emim]Br能使SAV蛋白酶热稳定性提高。

(3)在35℃、40℃和50℃的条件下，EminAc均使SAV蛋白酶的半衰期分别降低了25%，27%，22%；在45℃和60℃的条件下，EmimAc使SAV蛋白酶的半衰期增加了48%和22%。由此得出，45和60℃下，[Emim]Ac会提高SAV蛋白酶的热稳定性。

2.3 离子液体-SAV蛋白酶整理

2.3.1 不同催化工艺对羊毛表面鳞片层的影响

选用上述能使SAV蛋白酶活性提高最高的[Emim]Br，按1.2的方法进行整理，利用扫描电镜观察处理后的羊毛表面鳞片层的变化，以分析不同工艺防毡缩处理的效果，如图2所示。

(a)羊毛原毛 (b)Ps

(c)IL (d)IL+Ps

由图2 可知，与未经处理的原毛对比，(b)蛋白酶单独处理的羊毛纤维表面鳞片层有部分剥离，但是非常不均匀，对羊毛强力损伤较大；(c)离子液体单独处理的羊毛虽然也存在鳞片层部分剥离，但是去除程度较低且不均匀，而(d)离子液体预先处理工艺的羊毛纤维表面鳞片层去除程度较高，且剥离均匀。可能是离子液体的引入，能使蛋白酶充分的分散在离子液体中，不易产生局部催化效应，均匀的处理羊毛表面。同时，离子液体预先处理羊毛，首先能溶胀羊毛纤维，提高鳞片层的亲水性，使羊毛类脂层下的蛋白质外露，促进蛋白酶对羊毛的水解作用，其次也能增加生物酶的活性、热稳定性，使纤维的鳞片层得到较大程度破坏，提高羊毛防毡缩性能。

2.3.2 不同催化工艺对羊毛性能的影响

选用上述能使SAV蛋白酶活性提高最高的[Emim]Br，按1.2的方法进行整理，研究离子液体的加入对羊毛性能的影响，如表3所示。

表3 不同催化工艺对羊毛性能的影响

由表3可知，在不同的催化工艺中，离子液体与蛋白酶联合处理的羊毛的毡缩球体积最大，为7.76cm3，说明离子液体预先处理过后，蛋白酶对羊毛表面的鳞片作用较大，使得毡缩性降低，毡缩球体积较大。在不同的催化工艺中，蛋白酶单独处理的羊毛强力损伤比较严重，强力保留率只有86.0%，离子液体单独处理及联合处理的断裂强力相差不大，强力保留率在95%左右。蛋白酶单独处理羊毛的断裂强力下降比较多的原因可能是因为蛋白酶不能充分的分散在离子液体中，易产生局部催化效应，存在处理不均匀的现象，导致拉伸时应力会过于集中，断裂强力比较小。

3 结论

通过此次实验，我们发现离子液体对SAV蛋白酶羊毛防毡缩整理具有催化效果，是酶处理羊毛防毡缩整理中较为理想的反应介质。与传统溶剂相比，离子液体具有溶解能力强、挥发度低、不易燃、无毒、易回收等特点。而蛋白酶处理具有高效性、节约能源以及减少污染等特点。因此，将两者结合起来，共同应用于羊毛防毡缩整理中，不仅可以提升蛋白酶对羊毛的水解效果，而且可以降低传统氯化预处理对环境的危害，实现羊毛的生态加工，作为一种比较环保的防缩整理方法，这可能成为今后羊毛防毡缩整理的发展方向。

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Influence of Ionic Liquid on Wool Anti-felting Finishing Effect with SAV Protease

SHANSi-jia,SHENJia-jia,ZHANGHuan-xia

(Jiaxing University,Jiaxing 314001)

Based on the swelling property and catalytic performance of ionic liquid on wool,the ionic liquid was applied to the anti-felting finishing of protease in order to acquire more efficient anti-felting finishing method. The influence of three kinds of ionic liquid (HEMIM-[N(SO2CF3)2]，[Emim]Br and [Emim]Ac) on catalytic performance of SAV protease was studied. The results showed that [Emim]Br and [Emim]Ac were helpful to promote the activity and thermal stability of SAV protease at 45℃,and [Emim]Br could improve the activity of SAV protease by 25%. The influence of [Emim]Br on wool anti-felting finishing effect was studied by taking [Emim]Br with best catalytic effect as catalyst for SAV protease finishing. The experiment results displayed that ionic liquid had catalytic effect on wool anti-felting finishing with SAV protease,which was the ideal reaction medium when enzyme was used to treat wool anti-felting finishing.

anti-felting SAV protease ionic liquid enzyme activity catalysis

2016-11-16

浙江省纱线材料成形与复合加工技术研究重点实验室开放课题(MTC2014-002)

单思佳(1993-)，女，汉族，本科，研究方向：羊毛的绿色处理。

TS131.8

A

1008-5580(2017)02-0170-05