四川自贡地区健康人群中艾伯特埃希菌的分离鉴定

张 玲，刘 祥，许彦梅，李新琼，王 红，熊衍文



四川自贡地区健康人群中艾伯特埃希菌的分离鉴定

张 玲1，刘 祥1，许彦梅2，李新琼1，王 红1，熊衍文2

目的 了解长期从事鸡鸭等家禽养殖及屠宰人员等健康人群艾伯特埃希菌的携带情况。方法 收集家禽养殖、屠宰人群及其他健康人粪便，经EC肉汤增菌后PCR检测eae基因，阳性样品接种麦康凯琼脂，挑选不发酵乳糖菌落，通过16S rDNA序列分析和多位点序列分型(MLST)对菌株进行鉴定。分离株进行紧密粘附素亚型和cdtB亚型分析，并通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析与动物来源艾伯特埃希菌菌株间的相关性。结果 从189份从事鸡鸭宰杀人员的粪便中，分离到2株艾伯特埃希菌，从58份其他健康人群粪便中分离到1株菌，而138份家禽养殖场人员粪便中未分离到菌株。3株菌株的紧密粘附素亚型分别为sigma, iota 2, nu，cdtB亚型均为 II/III/V亚型。PFGE显示三株菌之间的带型相似性小于80%，并且与鸡鸭等来源的艾伯特埃希菌带型不同。结论 从事鸡鸭屠宰等健康人员中存在一定程度的艾伯特埃希菌携带率，但其与家禽携带艾伯特埃希菌的关系，仍需进一步研究。

艾伯特埃希菌；健康人群；eae；MLST；PFGE

艾伯特埃希菌是2003年命名的埃希菌属中的一个新种，作为一种肠道病原菌，可引起人感染性腹泻。1991年Albert等首次从孟加拉达卡腹泻儿童粪便标本中分离到艾伯特埃希菌[1]。由于艾伯特埃希菌缺乏区分其他肠道致病菌，尤其是区分大肠埃希菌的特异性生化特征，传统的商品化生化鉴定系统往往将艾伯特埃希菌鉴定为鲁氏耶尔森菌，沙门氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌，或大肠埃希菌等，使实验室对其鉴定存在相对困难，往往被误检为同样携带eae基因的EPEC/EHEC。目前主要采用多位点序列分型(MLST)，16srDNA测序等分子生物学方法，构建系统进化树进行聚类分析[2]。Ooka等[2]对278株eae阳性鉴定为大肠埃希菌的菌株进一步通过多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)等分析，从中鉴定出26株为艾伯特埃希菌，其中14株来自人，11株来自鸟类，1株来自猫科动物，14份来自人的菌株中，有13份是分离自胃肠道感染患者。近年来日本出现多起由艾伯特埃希菌引起的食物中毒报道[3-5]。2004年美国阿拉斯加出现的一起大规模金翅鸟雀死亡也与艾伯特埃希菌有关[6]，近期韩国的一项调查表明，多种鸟类可携带艾伯特埃希菌[7]。

目前国内对艾伯特埃希菌引起人类感染导致腹泻疾病的相关研究未见报道。我们前期从四川自贡地区市售生猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉中分离到艾伯特埃希菌，特别是鸡肠和鸭肠的检出率更高[8]。本研究旨在对中国四川省自贡市农贸市场中长期从事鸡鸭宰杀工作和养殖场中从事鸡、鸭及鹌鹑养殖的人群是否携带艾伯特埃希菌进行调查，并同时从市场中采用单纯随机抽样的方式抽取一部分工作地点远离鸡鸭宰杀摊位，从事与生鲜食品产销无关的人群作为对照，以探讨鸡鸭等携带艾伯特埃希菌对相关人群健康的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2015年6-7月，收集四川省自贡地区从事鸡、鸭、鹌鹑养殖场养殖人员粪便138份、农贸市场中鸡鸭屠宰人员粪便189份，并收集远离鸡鸭宰杀摊位，从事与生鲜食品产销无关的对照人群粪便58份。上述人员近期(2周内)均无腹泻病史。样品具体信息如表1所示。粪便样品置30%甘油的脑心肉汤保存管中，低温运送到自贡市疾病预防控中心实验室进行细菌分离培养。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 恒温恒湿生化培养箱(黄石恒丰)、电热恒温培养箱(上海一恒)、SensoQuest Labcycler PCR仪(德国SensoQuest)、GEL DocXR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad )。

1.2.2 主要试剂 EC肉汤、木糖、乳糖购于北京陆桥技术股份有限公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs 及DNA Marker：购于宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq MasterMIX(含染料)和DNA Marker(DM1000)：购自康为世纪生物科技有限公司；核酸染料(GeneGreen)：购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成及测序：由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.3 艾伯特埃希菌筛查 取1 mL左右粪便保存液于5 mL EC肉汤中，20 ℃震荡培养24—36 h。取1 mL增菌液至1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心8 min，弃上清，以100 μL去离子水重悬后，水煮10 min，10 000 r/min离心3 min，上清液作即为PCR检测模板，检测eae基因[3]。将eae基因检测阳性的EC增菌液，接种麦康凯琼脂，36 ℃培养过夜，挑选无色圆形光滑菌落，PCR检测eae基因。eae阳性菌落传代到营养琼脂培养基，过夜培养。菌株纯培养后进行乳糖、木糖发酵和动力试验。

1.4 艾伯特埃希菌菌株鉴定 将eae阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖及无动力菌株，进行16S rDNA序列分析，即以上游引物16S-F(5′-agagtttgatcmtggctcag-3′)和下游引物16S-R (5′-tacggytaccttgttacgactt-3′)PCR扩增疑似菌株，扩增产物测序后进行序列比对和聚类分析[9]。根据大肠埃希菌大肠埃希菌MLST数据库(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)提供的7个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)，对艾伯特埃希菌疑似菌株进行MLST分析。MLST参考菌株的选择、进化树构建按照文献进行[10]。

1.5 艾伯特埃希菌分子特征分析 紧密粘附素分型分析及cdtB基因检测和分型分析，参见文献[8]。参照PulseNet非O157大肠埃希菌PFGE分型方案，对3株艾伯特埃希菌进行PFGE分型分析，并使用BioNumerics 4.0软件对健康人群分离菌株及动物来源分离株构建UPGMA聚类树。

2 结 果

2.1 样品初筛结果 从189份从事鸡鸭宰杀人员的粪便中，分离到2株eae基因阳性不发酵乳糖和木糖、动力阴性的疑似菌株，检出率为1.06%；从138份家禽养殖场人员粪便中未分离到疑似菌株。从58份对照人群粪便中分离到eae基因阳性1份不发酵乳糖和木糖、动力阴性的疑似菌株，检出率为1.72%。家禽屠宰、养殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株筛查情况见表1。

表1 家禽屠宰、养殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株筛查情况
Tab.1 The situation of screening suspectedEscherichiaalbertiifor poultry slaughter population, poultry farming population and other healthy population

健康人群Healthypopulation初筛阳性率%Screeningpositiverate%家禽屠宰人群Poultryslaughterpopulation1.06(2/189)家禽养殖人群Poultrybreedingpopulation0(0/138)其他健康人群Otherhealthypopulation1.72(1/58)合计Total0.78(3/385)

2.2 疑似菌株的鉴定

2.1.1 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列分析基因测序长度为1 506 bp，去掉两端测序无效的序列，最后获得1 404 bp长度序列用于分析。系统进化树表明此次分离的3株菌株与艾伯特埃希菌参考菌株LMG 20976、KF1、NBRC107761、TW07627等相似性最大，而与大肠埃希菌、弗格森埃希菌等参考菌株差异较大，支持这3株疑似菌株均为艾伯特埃希菌。

2.1.2 多位点序列分析(MLST) 按照大肠埃希菌MLST数据库提供的分型方案，获得7个管家基因的序列，并将这7个基因的序列拼接后获得3 423 bp长度的序列，以大肠埃希菌K-12 MG1655的序列为参考与艾伯特埃希菌参考菌株LMG 20976、KF1菌株序列构建Neighbor-Joining树，见图1。MLST分析表明，3株疑似菌株中有2株序列完全一致，与另一株存在较小的差异，这3株分离株均与艾伯特埃希菌亲缘关系最近。根据16S rDNA序列分析和MLST分析结果，可以确定这3株疑似菌株菌为艾伯特埃希菌。

图1 3株艾伯特埃希菌与参考菌株基于7个管家基因序列的Neighbor-Joining树Fig.1 Neighbour-joining dendrogram of three E.albertii strains and reference strains based on the seven housekeeping genes

2.3 菌株分子生物学特征

2.3.1 紧密粘附素亚型及cdtB分型结果 根据紧密粘附素全长序列的聚类分析结果，从鸡鸭宰杀人群粪便中分离的TS20150072菌株是Sigma亚型，TS20150248菌株是iota 2亚型，而对照人群粪便中分离的TS20150298菌株属于nu亚型。3株分离株cdtB亚型均为II/III/V亚型群，见图2。

2.3.2 PFGE分型结果 3株健康人群的艾伯特埃希菌均产生了较清晰的条带，并且3株菌之间的PFGE带型均不相同。通过与数据库中来自鸡肠、鸭肠、鸡肉、鸭肉、猪肉、羊肉及白鹭粪便中分离的48株艾伯特埃希菌PFGE带型聚类比较分析，发现这3株健康人群菌株的带型与动物源性菌株的PFGE带型存在差异，且聚类相似性均小于80%，见图2。

3 讨 论

艾伯特埃希菌作为一种非常重要的潜在新发食源性致病菌，它可以引起人类胃肠道疾病，如腹泻、腹胀、发热、脱水、呕吐等，与多起食源性疾病爆发有关[11-12]。日本有多起报道从肠胃炎的患者中分离鉴定出艾伯特埃希菌[13-14]，美国明尼苏达州和伊利诺斯州的腹泻患者、几内亚比绍儿童也分离到该菌[6、15-16]。Inglis TJ 等在患有胃肠道感染的76岁菌血症患者的血液、粪便中检出艾伯特埃希菌，是第一例艾伯特埃希菌肠外感染病例[17]。

艾伯特埃希菌是一种引起人畜共患病的病原体，因此在家禽家畜，野生动物，鸟类等动物宿主也有报道检出。中国四川地区从野生白鹭分离到1株，从鸡肠、鸭肠中分离到37株艾伯特埃希菌[8],Ooka等从1株来自猫科动物样本中鉴定出1株艾伯特埃希菌[2]，此外，在北美、欧洲、澳大利亚的各种野生和家养鸟类中也检出了艾伯特埃希菌[6]。在各种食品和饮用水中也有艾伯特埃希菌感染的报道。中国四川地区从鸡肉、羊肉、猪肉、鸭肉分离到7株艾伯特埃希菌[8]，在在美国的鸡漂洗液中也检出艾伯特埃希菌[18]。在匈牙利医院的饮用水分配系统中也有检出[19]。

图2 3株健康人群艾伯特埃希菌分离株与48株动物源性艾伯特埃希菌菌株的PFGE带型聚类图Fig.2 Dendrogram of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) profiles of E.albertii between 3 strains from people stool and 48 strains from animal derived food

本项目在鸡肠、鸭肠、鸡肉、鸭肉检出较多艾伯特埃希菌，那么长期从事鸡鸭养殖、宰杀等的人群危险性是否高于一般的人群，这种危险性是否造成艾伯特埃希菌感染的流行都需要加以关注。本次研究为主动监测，从189份从事鸡鸭宰杀人员的粪便中，分离到2株艾伯特埃希菌，从58份其他健康人群粪便中分离到1株菌，而138份家禽养殖场人员粪便中未分离到菌株，说明健康人群中确实携带该菌。国外暂时未见对密切接触人群艾伯特埃希菌感染情况调查的报道。

通过PFGE带型的对比分析，此次分离的3株菌株与鸡肠、鸭肠、鸡肉、鸭肉、牛肉、白鹭等样品中分离的菌株的带型存在差异，暂时未发现两者之间的遗传学联系。但是此次实验说明从事鸡鸭宰杀的人群确实能检出艾伯特埃希菌，也就是说这类人群是可能成为病原体的传染源。

目前国内外都缺乏艾伯特埃希菌商品化生化鉴定系统，限制了在食物中艾伯特埃希菌的发病率调查。我国作为食源性腹泻多发国家之一，艾伯特埃希菌很可能是导致腹泻疾病的病原体，因此在我国系统的开展对该菌的检测，研究致病机制，确定危险因素，对有效控制该菌的感染和暴发至关重要。下一步可以通过增加样本量来提高检出率，通过多元统计分析确定艾伯特埃希菌感染的高危因素。通过建立该病原体检测的技术储备，结合分子生物学研究，对艾伯特埃希菌早期发现、早期诊断、有效控制，进而保护人群健康具有重要的公共卫生学意义[20]。

[1] Albert MJ, Alam K, Islam M, et al.Hafniaalvei, aprobable cause of diarrhea in humans[J]. Infect Immun, 1991, 59(4): 1507-1513.DOI: 0019-9567/91/041507-07$02.00/0

[2] Ooka T, Seto K, Kawano K, et al. Clinical significance ofEscherichiaalbertii[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(3): 488-492. DOI: 10.3201/eid1803.111401

[3] Asoshima N, Matsuda M, Shigemura K, et al. Identification ofEscherichiaalbertiias a causative agent of a food-borne outbreak occurred in 2003[J]. Jpn J Infect Dis, 2014, 67(2): 139-140. DOI: 10.7883/yoken.67.139

[4] Konno T, Yatsuyanagi J, Takahashi S, et al. Isolation and identification ofEscherichiaalbertiifrom a patient in an outbreak of gastroenteritis[J]. Jpn J Infect Dis, 2012, 65(3): 203-207. DOI: 10.7883/yoken.65.203

[5] Ooka T, Tokuoka E, Fukawa M, et al. Human gastroenteritis outbreak associated withEscherichiaalbertiiJapan[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 9(1): 144-146. DOI: 10.3201/eid1901.120646

[6] Oaks JL, Besser TE, Walk ST, et al.Escherichiaalbertiiin wild and domestic birds[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(4): 638-646. DOI: 10.3201/eid1604.090695

[7] Oh JY, Kang MS, Hwang HT, et al. Epidemiological investigation of eaeA-positiveEscherichiacoliandEscherichiaalbertiistrains isolated from healthy wild birds[J]. J Microbiol, 2011, 49(5): 747-752. DOI: 10.1007/s12275-011-1133-y

[8] Wang H, Li Q, Bai X, et al. Prevalence of eae-positive, lactose non-fermentingEscherichiaalbertiifrom retail raw meat in China[J]. Epidemiol Infect, 2015, 10: 1017-1024.DOI: 10.1017/S0950268815001120

[9] Wang B, Wang H, Xiong YW, et al. Application of 16S rDNA sequence in identification ofEscherichiaalbertii[J]. Dis Surveill, 2016, 31(3): 205-208.(in Chinese)

王斌,王红,熊衍文,等.16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用[J].疾病监测,2016,31(3):205-208.

[10] Liu X, Xu YM, Wang H, et al. Application of multi-locus sequence typing (MLST) in the identification ofEscherichiaalbertii[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2015, 31(11): 1033-1036.(in Chinese)

刘祥,许彦梅,王红,等.多位点序列分型(MLST)技术在艾伯特埃希菌鉴定中的应用[J].中国人兽共患病学报,2015,31(11):1033-1036.

[11] Abbott SL, O’Connor J, Robbin T, et al. Biochemical properties of a newly describedEscherichiaspecies,Escherichiaalbertii[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(10): 4852-4854. DOI:10.1128/JCM.41.10.4852-4854.2003

[12] Huys G, Cnocker M, Janda JM, et al.Escherichiaalbertiisp. nov., a diarrhoeagenic species isolated from stool specimens of Bangladeshi children[J]. Intl J Systemat Evolutionary Microbiol, 2003, 53(3): 807-810. DOI:10.1099/ijs.0.02475-0

[13] Konno T, Yatsuyanagi J, Takahashi S, et al. Isolation and identification ofEscherichiaalbertiifrom a patient in an outbreak of gastroenteritis[J]. Jpn J Infect Dis, 2012, 65(3): 203-207. DOI: 10.7883/yoken.65.203

[14] Murakami K, Etoh Y, Takana E, et al. Shiga toxin 2f-producingEscherichiaalbertiifrom a symptomatic human[J]. Jpn J Infect Dis, 2014, 67(3): 204-208. DOI: 10.7883/yoken.67.204

[15] Hyma KE, Lacher DW, Nelson AW, et al. Evolutionary genetics of a new pathogenicEscherichiaspecies:Escherichiaalbertiiand relatedShigellaboydiistrains[J]. J Bacteriol, 2005, 187(2): 619-628. DOI:10.1128/JB.187.2.619-628.2005

[16] Valentiner-Branth P, Steinsland H, Fischer TK, et al. Cohort study of Guinean children: incidence, pathogenicity, conferred protection, and attributable risk for enteropathogens during the first 2 years of life[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(9): 4238-4245. DOI:10.1128/JCM.41.9.4238-4245.2003

[17] Inglis TJ, Merritt AJ, Bzdyl N, et al. First bacteraemic human infection withEscherichiaalbertii[J]. New Microbes New Infect, 2015, 16 (8): 171-173.DOI: 10.1016/j.nmni.2015.07.003

[18] Lindsey RL, Fedorka-Cray PJ, Abley M, et al. Evaluating the occurrence ofEscherichiaalbertiiin chicken carcass rinses by PCR, Vitek analysis, and sequencing of therpoBgene[J]. Appl Environmental Microbiol, 2015, 81(51): 1727-1734. DOI: 10.1128/AEM.03681-14

[19] Felfoldi T, Hegeer Z, Vargha M, et al. Detection of potentially pathogenic bacteria in the drinking water distribution system of a hospital in Hungary[J]. Clin Microbiol Infect, 2010, 16(1): 89-92. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2009.02795.x

[20] Xu JG. Discovery of new pathogen and associated technology and basic theory[J].J Microbes Infect, 2015, 5(3): 129-134.(in Chinese)

徐建国.发现新病原、建立新病原学的技术与理论体系[J].微生物与感染,2010,5(3):129-134.

Identification ofEscherichiaalbertiifrom healthy carriers in Zigong,Sichuan Province, China

ZHANG Ling1, LIU Xiang1,XU Yan-mei2, LI Xin-qiong2,WANG Hong1, XIONG Yan-wen2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China；2.StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the carrying situation ofEscherichiaalbertiifrom healthy people engaged in breeding and slaughtering poultry for a long time. We collected stool samples from people engaged in breeding and slaughtering poultry and other healthy people. After enriched with EC broth,eae-positive enrichment culture was directly streaked on MacConkey, andeae-positive lactose non-fermenting isolate was retained for further investigation. The 16S rDNA sequencing and multilocus sequence typing (MLST) were applied in the identification ofE.albertiifrom suspected strains. Intimin subtypes andcdtBtypes ofE.albertiistrains were detected. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to detected genetic polymorphism of strains from this study and animal source ones. Results showed that two isolates were identified asE.albertiifrom 189 stools of people exposed to slaughtering chickens and ducks and one from 58 stools in control groups. No isolate was identified asE.albertiifrom 138 stools samples of people exposed to breeding poultry. Intimin subtypes of three isolates from stool samples were subtyped as sigma, iota 2, nu, andcdtBtypes were closely related to types II/III/V. PFGE patterns of the three strains was distinguishable (<80% similarity), and appeared in different cluster with chickens, ducks and other sources ofE.albertiistrains. The rate of carryingE.albertiito a certain extent exist in healthy people engaged in slaughtering chickens and ducks, and the relationship between these strains and strains from poultry should be further investigated.

Escherichiaalbertii; healthy carriers; eae; MLST; PFGE

s:Wang Hong, Email: 460973389@qq.com；Xiong Yan-wen, Email: xiongyanwen@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.019

自贡市重点科技计划项目(No.2013S06)，四川省卫生和计划生育委员会科研课题(No.150259),传染病预防控制国家重点实验室开放课题(No.2016SKLID309)联合资助

王 红，Email: 460973389@qq.com； 熊衍文，Email: xiongyanwen@icdc.cn

1.自贡市疾病预防控制中心，自贡 643000； 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206

R378

A

1002-2694(2017)06-0569-05

2016-09-01 编辑：梁小洁

Supported by the Zigong Key Science and Technology Program(No.2013S06),the Health and Family Planning Commission of Sichuan Province(No.150259)and the Open Project from State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control(No.2016SKLID309)