气相色谱-质谱联用测定奥美沙坦酯中基因毒性杂质4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮

刘勇军，熊学武，巢燕芳，杨铁金

(1 齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161000；2 东阳光药物研究院，广东东莞 443300)



气相色谱-质谱联用测定奥美沙坦酯中基因毒性杂质4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮

刘勇军1，2，熊学武2，巢燕芳2，杨铁金1

(1 齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161000；2 东阳光药物研究院，广东东莞 443300)

通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)法，测定奥美沙坦酯原料药中基毒杂质4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮 (4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-one，DMDO-Cl)。选用4，5-二甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮(DMDO)为内标物，奥美沙坦酯原料药经1%甲酸的二氯甲烷溶解后，加入正庚烷使奥美沙坦酯析出。取上述清液，用DB-624色谱柱(30m×0.32mm×1.8μm)分离，使用氦气为载气，流速2mL/min，分流比1∶1，程序升温模式，进行测定。用电子轰击(EI)质谱，在离子选择(SIM)模式下，监控m/z113与m/z114离子进行检测，测定痕量DMDO-Cl。研究记过表明，该检查方法具有重现性好、灵敏度高、准确可靠的特点。

奥美沙坦酯，基因毒性杂质，气质联用，杂质痕量检测

奥美沙坦酯(Olmesartan medoxomil)是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物[1]，主要用于高血压的治疗。该药物由日本Sankyo (三共公司)和美国Forestlaboratories共同开发，于2002年在美国上市。相对同类降压药，具有剂量小、起效快、半衰期长、不良反应率低等明显优点。4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮(DMDO-Cl)是奥美沙坦酯合成中用到的一个关键起始物料，含有一级卤代烷基结构，属于潜在基因毒性杂质[2]。因其通常用于工艺的最后步骤[3-4]，较难被降低到毒理学关注阈值(TTC，Threshold of Toxicological Concern)限度以下。回顾近几年国内外药政法规动向，各主要规范市场(中国、美国、欧盟)官方对于药物中潜在基因毒性杂质的要求越来越严格，要求建立方法控制药物中的潜在基因毒性杂质，限度为不超过1.5μg/day[5-6]。结合奥美沙坦酯的最大日剂量40mg/day，样品中DMDO-Cl含量不得超过37.5mg/kg。

DMDO-Cl是一种浅黄色透明油性液体，可通过向药物分子中引入甲基-1，3-间二氧杂环戊烯-2-酮结构单元，使药物分子的生物利用度大为提高[7-8]，故被广泛用于制药业(如阿齐沙坦酯钾[9]等的合成)。文献有报道采用气相色谱(GC)配火焰离子检测器(FID)的方法测定DMDO-Cl含量[10]，但是方法的基质效应影响大，灵敏度低，不适用于痕量检测。对于痕量杂质的检测，通常基于化合物性质，选择液相或者气相进行分离。如果采用气相色谱，常用的检测器通常为电子碰撞(EI)或化学电离(CI)质谱，也可采用对卤素原子具有选择性的离子俘获检测器(ECD)[11-13]。

本研究采用气相色谱-质谱联用法测定奥美沙坦酯中的DMDO-Cl。该方法过程包括通过沉淀法[14]，最大程度降低基质效应；再选用4，5-二甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮为内标物，减少色谱进样量和仪器的波动；最后使用质谱作为定量手段，提高灵敏度。研究结果表明，故该方法具有基质效应低、重现性好、灵敏度高等特点，对DMDO-Cl在其他药物中的检测具有借鉴意义。

1 DMDO-Cl制备

1.1 合成路线

图1 DMDO-Cl合成路线图Fig.1 Synthetic Route of DMDO-Cl

1.2 提纯过程

将羟基丁酮溶于甲苯，并加入催化量三乙胺。随后滴加三光气的二氯甲烷溶液。搅拌使反应完成。所得产物水洗，干燥，用异丙醚重结晶，得到DMDO。将DMDO溶于二氯甲烷，滴加二氯亚砜，冰浴搅拌促使反应完成，得到DMDO-Cl。

2 分析检查

2.1 仪器与试剂

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(配EI离子源，美国Agilent Technologies 公司)；梅特勒XPE-205DR电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；二氯甲烷(色谱纯，美国Spectrum公司)；正庚烷(色谱纯，科鲁德化工股份有限公司)；甲酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；4，5-二甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮(DMDO，内标物，上海Accela公司，含量97%)；DMDO-Cl标准品(东莞东阳光药物研发有限公司标定，含量88.2%)；奥美沙坦酯原料药(API，广东东莞东阳光药物研发有限公司，含量99.8%)。

2.2 内标储备溶液配制

取DMDO，加二氯甲烷稀释至0.095mg/mL。移取10mL上述溶液至500mL容量瓶，加5mL甲酸，用二氯甲烷稀释定容得到内标储备液(浓度1.9μg/mL)。

2.3 对照溶液配制

取DMDO-Cl约59mg，加内标储备液稀释至1.9μg/mL得到对照储备液。移取2mL上述溶液至10mL容量瓶，加正庚烷稀释定容得到对照溶液(浓度0.38μg/mL)。

2.4 样品溶液配制

样品溶液：取奥美沙坦酯API约100mg，至10mL容量瓶，加入2.0mL内标储备液溶解，再加入正庚烷定容，摇匀，密封静置7h，待奥美沙坦酯充分析出后，取上清液为样品溶液(浓度：10mg/mL，含内标DMDO 0.38μg/mL)。

空白溶液：取2.0mL内标储备，至10mL容量瓶，用正庚烷稀释定容。

样品加标溶液配制(仅供专属性和重复性实验)：称取100mg样品，置于10mL容量瓶中，加入2.0mL对照储备液(1.9μg/mL)溶解，再加入正庚烷定容。摇匀，静置7h。取上清液为样品加标溶液。

2.5 检测条件

2.5.1 气相色谱条件

色谱柱：DB-624(30m×0.32mm×1.8μm)；进样口温度：180℃；载气：氦气；流速：2.0mL/min(恒流模式)；进样量：1.0μL；分流比：1∶1；炉温：程序升温模式(在60℃下保持3min，之后以20℃/min升温至220℃，保持10min)；检测器：火焰离子检测器(FID)，温度250℃；采样频率：20Hz。

2.5.2 质谱条件

电子轰击离子源(EI离子源)；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；MS传输线温度：280℃；溶剂延迟：7.0min；电子倍增器模式：Gain factor；增益因子：1.0；MS扫描模式：离子选择(SIM)；提取离子：7.0min～11.0min(m/z=114.0)，11.0min～21.0min(m/z=113.0)

3 结果与讨论

3.1 样品溶液处理方式的选择

奥美沙坦酯易溶于丙酮和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，溶于二氯甲烷，不溶于正庚烷；DMDO-Cl易溶于正庚烷。本实验尝试了多种样品处理方式，列举三条代表性方式对比如下：

(1)取50mg样品溶于5mL丙酮，所得溶液直接进样检测：因主成分奥美沙坦酯影响杂质DMDO-Cl出峰响应，导致方法准确度不合格。

(2)取100mg样品溶于1.0mL DMF，随后加入3.0mL超纯水(降低DMDO-Cl在DMF中溶解度)，再加2.0mL正庚烷萃取。振摇1min，静置2min，取上清液为供试液：因萃取回收率较差，导致重现性差。

(3)取100mg样品溶于2.0mL含DMDO(1.9μg/mL)的1%甲酸-二氯甲烷溶液中，加入8mL正庚烷使奥美沙坦酯全部析出，取上清液为供试液：该方式通过加入1%甲酸助溶，使样品完全溶于二氯甲烷，充分释放其中的DMDO-Cl，随后加入正庚烷，使奥美沙坦酯充分析出，降低基质效应，以提高回收率，获得良好重现性和回收率。

3.2 内标物的选择

为降低气相色谱进样和仪器稳定性影响，选用结构与DMDO-Cl接近，且不与样品反应，不干扰DMDO-Cl出峰的DMDO作为内标物。

3.3 裂解途径

蒋介石在国民党执政的二十余年间，随着个人权势及外在环境的变化，不同时期对于党义阐述的重点和指向会有不同，其宣导的对象亦在不断扩大，但随着国民党在大陆失败的临近，其宣导的效果及实际影响的范围不断衰微。

DMDO-Cl在EI离子源作用下，裂解情况如下。选用(1)为待测离子，因其丰度高，基线噪音低。

3.4 系统适应性

取空白溶液、对照溶液、依法检测。重复进样三针对照溶液，所得结果中DMDO-Cl相对DMDO的校正因子均值为1.17，三针RSD为1.0%，说明本法系统适应性良好。

3.5 专属性实验

分别取空白溶液、对照溶液、样品溶液、样品加标溶液，依法测定。记录SIM谱图，分别见图2。结果显示空白溶液在离子选择模式下无DMDO-Cl背景干扰，对照溶液、样品溶液、样品加标溶液中DMDO-Cl与相邻峰分离度分别2.86、2.56、3.21，达到基线分离要求。

图2 空白溶液(a)，对照溶液(b)，样品溶液(c)，样品加标溶液(d)选择离子检测图谱Fig.2 Chromatogram of Blank Solution (a)，Standard Solution (b) and Sample Solution (c) and Spiked solution (d)

3.6 重现性实验

平行配制6份样品加标溶液，并依法检测。6次测定结果的RSD为1.77%，具有良好的重复性。

取不同量的DMDO-Cl，用内标储备液稀释，得到一系列浓度(0.57μg/mL、0.944μg/mL、1.416μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL，对应 11.2mg/kg、18.7mg/kg、28.1mg/kg、37.5mg/kg、56.2mg/kg)的DMDO-Cl线性溶液。测定该系列溶液，并计算DMDO-Cl与DMDO的峰面积比。分别以峰面积比(Y)对DMDO-Cl质量浓度(X，μg/mL)进行回归方程拟合。结果表明：在0.57μg/mL～2.832μg/mL(11.2mg/kg～56.2mg/kg，相当于限度37.5mg/kg的30%～150%)浓度范围内，峰面积比值与浓度线性关系良好，线性方程为Y=2.308X-0.007(r=0.9997)。该方法最低定量浓度为0.57μg/mL(11.2mg/kg)。

3.8 加标回收率及相对偏差

取样品100mg，分别置于10mL容量瓶中，加入2.0mL DMDO-Cl线性溶液，浓度分别为0.57μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL(对应限度的30%、100%、150%)，每个浓度平行配置三份，依法测定。实验结果显示，9份准确度溶液中，DMDO-Cl的加标回收率在94.1%～100.3%之间，回收率RSD为2.36%(见表1)。表明方法准确度良好，能满足检测要求。

表1 奥美沙坦酯中DMDO-Cl的加标回收实验结果(n=9)Table 1 Results of Recovery for DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil (n=9)

3.9 实际样品分析

该研究对宜昌东阳光药业送检的几个批次的样品进行了分析，结果表明，产品中DMDO-Cl虽有波动(见表2)，但均低于TTC限度(37.5mg/kg)，符合药政官方质量要求。

表2 奥美沙坦酯中DMDO-Cl含量检测结果Table 2 Content of DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil Drug Substance

4 结论

建立了一种通过气相色谱-质谱联用，测定奥美沙坦酯中DMDO-Cl含量的新方法。研究结果表面，该检测方法稳定可靠，准确度高，灵敏度高，适合于痕量DMDO-Cl的检测。

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Determination of Genotoxic Impurity of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone in Olmesartan Medoxomil using Gas Chromatograph-Mass Spectrometry (GC-MS) Method

LIU Yong-jun1，2，XIONG Xue-wu2，CHAO Yan-fang2，YANG Tie-jin2

(1 College of Chemistry and Chemical Engineering，Qiqihaer University，Heilongjiang Qiqihaer 161000，Heilongjiang，China；2 HEC Pharm Research and Development Institute，Dongguan 443300，Guangdong，China)

A gas chromatograph-mass spectrometric (GC-MS) method was developed for the determination of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone，which is classified as genotoxic impurity and may present in Olmesartan medoxomil drug substance (API) in trace level. The 4，5-dimethyl-1，3-dioxol-2-one (DMDO) is selected as internal standard. In order to avoid matrix interference，the Olmesartan medoxomil test sample was firstly dissolved in-dichloromethane (DCM) with the aid of 1% formic acid，then n-hexane was added to allow the Olmesartan medoxomil to precipitate completely. The supernatant obtained was injected into the DB-624 column (30m×0.32mm×1.8μm)，and separated by using helium as carrier gas at flow rate of 2mL/min and split ratio of 1∶1 under temperature programming mode. The detection of the DMDO-Cl was performed by mass spectrometry (MS) under Single Ion Monitoring (SIM) Mode. Selective ion monitors were set atm/z113 for DMDO-Cl andm/z114 for DMDO. The method was proved to be of good reproducibility，high sensitivity，accuracy and reliability.

Olmesartan medoxomil，genotoxic impurity，gas chromatograph-mass spectrometry，determination of Impurities at ppm Level

杨铁金，学位，教授，研究方向：色谱分析，电化学分析；E-mail：tiejin99@126.com；Tel：0452-2742572

O 657

广州市产学研协同创新重大专项项目(项目编号：201604010105)