七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及对线粒体融合蛋白2表达和PI3K-Akt通路的影响

杨 春，范志强，王建刚，田首元，金弋乔，李 翔，朱 健

·基础医学论著/研究·

七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及对线粒体融合蛋白2表达和PI3K-Akt通路的影响

杨 春1，范志强2，王建刚3，田首元3，金弋乔1，李 翔1，朱 健3

目的 探讨七氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用以及其对线粒体融合蛋白2(Mfn-2)的表达和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路的影响。方法 将30只SD大鼠随机分为5组：S组、MIRI组、SP组、SP+W组、W组，每组6只。麻醉固定大鼠暴露心脏，除外S组，其余4组均结扎左前降支30min，复灌120min，SP组在复灌前10min吸入2.3%七氟醚15 min，SP+W组在吸入前股静脉注射稀释的渥曼青霉素1 mL，W组则只在复灌前静注渥曼青霉素。结束后检测指标：ELISA法测cTn-I，蛋白免疫印迹法检测总Akt、P-Akt、Mfn-2的表达，电镜下观察心肌细胞形态学变化。结果 各组总Akt接近，差异无统计学意义(P>0.05)。与S组相比较，其他各组cTn-I含量、P-Akt表达上调，差异有统计学意义；与SP组比较，MIRI组、SP+W组、W组cTn-I表达上调，P-Akt表达下调，差异均有统计学意义(P<0.05)；MIRI组、SP+W组、W组组间cTn-I、P-Akt表达接近，差异无统计学意义。与S组相比较，其他各组Mfn-2表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)；SP组与SP+W组Mfn-2表达差异无统计学意义(P>0.05)，MIRI组与W组Mfn-2表达差异无统计学意义(P>0.05)；与SP组、SP+W组比较，MIRI组与W组Mfn-2表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。电镜下显示S组无受损迹象，SP组明显较MIRI组、SP+W组、W组损伤减轻。结论 七氟醚后处理通过下调Mfn-2表达进而激活PI3K-Akt通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。

七氟醚后处理；心肌缺血再灌注损伤；线粒体融合蛋白2；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶

在应对心血管事件中，重新恢复血流有时会造成一个新的加重心脏损害，多引起细胞凋亡，称之为缺血再灌注损伤(MIRI)[1]。其区别于急性心肌梗死[2]。有文献证实七氟醚可以减轻这一损伤[3]。七氟醚在临床上广泛使用[4]，对于心肌保护具有良好的便利性。其中涉及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)[5]和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)这一信号转导通路[6]。线粒体融合蛋白2是线粒体外膜上高度保守的鸟苷三磷酸(GTP)酶，是线粒体外膜上非常重要的蛋白之一，除外已知的调控线粒体形态，还介导细胞的凋亡，该蛋白具有双向性，有文献发现其既具有抗凋亡的作用，同时又证实该蛋白也促进凋亡。Mfn-2作用与细胞种类和细胞状态有关[7]。目前，有文献发现Mfn-2在大鼠心肌细胞中的作用表现为促进凋亡[8]。人和大鼠有95%的同源性[7]，因此本次试验选取大鼠作为实验动物。PI3K-Akt通路通过对下游靶蛋白进行磷酸化从而抑制细胞凋亡、抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性阻止凋亡级联反应的激活，还有促进P53降解等途径，发挥其在心肌细胞凋亡中的保护作用[9]。然而对于这两个保护因素是否处于同一路径，谁又在机制上游，少有报道。故本课题拟研究七氟醚在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用，探讨Mfn-2表达和PI3K-Akt通路的作用及两者的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 七氟醚(批号：H20070172，上海恒瑞)，20%乌拉坦溶液(山西医科大学生理实验室)，Wortmannin与稀释液(上海拜力生物科技有限公司)，肌钙蛋白I(cTn-I) ELISA试剂盒(Bio-Swamp ELISA Reagents)，Akt、Mfn-2试剂盒(abcam)P-Akt试剂盒(CST)，大鼠用呼吸机(型号HX-300)，七氟醚挥发器(Vapor 2000七氟醚专用蒸发器 )，透射电镜(JEM-1011，JEOL)，离心机、测吸光度、绘制标准曲线等其余检测仪器或技术支持均由山西医科大学生理实验室提供。

1.2 动物选取与分组 30只健康雄性SD大鼠，体重200 g～300 g，由北京市海淀兴旺动物养殖场提供，许可证号[SCXK-20140013]，利用计算机软件随机分为5组：手术组(S组)、缺血再灌注组(MIRI组)、七氟醚后处理组(SP组)、七氟醚后处理+PI3K-AKT通道抑制剂Wortmannin组(SP+W组)、抑制剂Wortmannin组(W组)，每组6只。

1.3 模型的制备 腹腔注射20%的乌拉坦(4 mL/kg)麻醉禁食12 h的大鼠，随后用丝线和医用胶布将大鼠的门齿和四肢分别固定于37 ℃恒温台，使其呈四肢外展的水平仰卧位。将心电图电极联于大鼠肢体(分别联于左右上肢及右下肢)，并开始记录Ⅱ导心电图，取样保存。随后将颈部气管暴露，切开气管，并将调节好的动物呼吸机(频率设定为40次/min，潮气量为1.4 mL～2.1 mL，具体为每增加1 kg体重增加7 mL，吸呼比设置为1∶3，避免非常规量呼吸对心脏损伤的影响)[10]，将气管导管插入气管，并用丝线系紧，丝线起固定导管，封闭导管与气管间隙作用。于胸骨左缘在3～4肋间处，触摸到心脏最强搏动，此处备皮，沿肋间钝性分离肌肉，扩胸器支撑下暴露心脏，轻轻除去外层心包膜，确认左前降支后，用丝线穿过该血管下方(6-0带线圆针，深度约为2 mm，进针口与出针口跨度约为4 mm)，待心电图稳定后，适当力度结扎，观察心电图ST段动向，以Ⅱ导联中抬高>0.1 mV或T波高尖为有效[11]，选取有代表性波形。开始计时，结扎时间为30 min，过程中观察心脏是否有变暗红色的区域，则该区域为左前降支供血区域。其中S组丝线只穿过而不结扎，其余各组结扎左前降支30 min后，复灌120 min，依据心电图ST段变化(抬高的ST段和T波应该有回落)和心脏颜色变化(变暗红区域颜色有所恢复)确定建立成功的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。SP组在结扎20 min时(即复灌前10 min)通过呼吸机吸入1MAC(2.3%)七氟醚持续15 min，SP+W组在吸入七氟醚前通过股静脉注射给15 μg/kg的Wortmannin稀释液1 mL；W组则只在复灌前静注Wortmannin。其中Wortmannin为PI3K-Akt通道抑制剂。整个实验过程采用湿润生理盐水纱布覆盖伤口，以减少大鼠体液挥发与体温散失。

1.4 测量指标

1.4.1 取样检测指标 复灌后随即开腹，采血针穿刺进入腹主动脉，抽取新鲜动脉血液入促凝采血管静置待血液凝固后离心(离心10 min，转速为3 000 r/min)用微量枪取上清液分装到EP管(塑料离心管)于-20 ℃保存后，实验后期测量cTn-I含量。另外将左前降支供血的变色心尖部剪下，用生理盐水冲洗干净后置于标本袋，一小部分(每块≈1 mm3、三四块)固定包埋固化切片染色用于后期透射电镜下观察心尖缺血组织的亚细胞结构损伤情况，剩余在-80 ℃保存用于Western Blot法检测P-Akt、总Akt的含量，并计算其比值，检测Mfn-2蛋白的表达情况。

1.4.2 血清中cTn-I含量检测 酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清中cTn-I含量，具体步骤按照所购试剂盒说明书操作。解冻EP管中的血清样品，用一系列浓度梯度的标准品制作含量与吸光值的标准曲线，通过检测出的样本吸光值来逆推各样品的cTn-I含量。

1.4.3 心肌组织中Akt、磷酸化的Akt即被激活的Akt(P-Akt)、Mfn-2的表达，蛋白免疫印迹法检测心肌组织中Akt、P-Akt、Mfn-2的表达 取存于-80 ℃冰箱的心肌组织，称重、剪碎、以1∶10的比例加入裂解液、以13 000 r/min离心15 min取上清液BCA法测蛋白浓度。完成配胶、电泳分离蛋白，以marker确定目标蛋白位置、转膜、洗膜、封闭液室温封闭、孵一抗、孵二抗后，使用ECL化学发光即用型底物显影曝光，分析目标蛋白灰度值，并用各自的内参(本内参为GAPDH)校正。

1.4.4 透射电镜下观察心肌组织切片中心肌细胞超微结构的损伤情况 2.5%戊二醛、0.1 mol/L磷酸缓冲液、1%锇酸固定液用以固定。一定浓度的乙醛、丙酮用以包埋。随后固化切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，电镜下观察心尖缺血组织的亚细胞结构损伤情况。

2 结 果

2.1 各组检测指标比较 各组总Akt接近，GAPDH接近，差异无统计学意义，表明各样本上样量基本一致。与S组比较，其余各组cTn-I含量、P-Akt/总Akt、Mfn-2表达明显升高，差异有统计学意义。与SP组比较，MIRI组、SP+W组、W组cTn-I表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)；MIRI组、SP+W组、W组P-Akt/总Akt升高，差异有统计学意义(P<0.05)；MIRI组、SP+W组、W组间cTn-I、P-Akt/总Akt差异均无统计学意义。SP组、SP+W组之间Mfn-2表达差异无统计学意义，MIRI组、W组之间Mfn-2表达差异无统计学意义，SP组、SP+W组Mfn-2表达低于MIRI组、W组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组检测指标比较(±s)

2.2 电镜下观察心肌组织切片中心肌细胞形态学 S组线粒体结构清晰完整；MIRI组、SP+W组、W组可观察到细胞呈浓缩现象，核染色质浓缩、集边现象，部分细胞可见线粒体肿胀、嵴断裂甚至空泡现象；SP组凋亡现象较MIRI组、SP+W组、W组减少。

3 讨 论

MIRI防治的研究一直是医学热点。受制于伦理，本实验借用大鼠MIRI模型，来评价七氟醚这一保护现象，虽然结果明确，但是其中仍有许多问题需要被探索阐明。Mfn-2的功能较多，而其在细胞凋亡中的作用是难点之一，或抑制凋亡，或促进凋亡，具体原因尚未明了。虽然已知PI3K-Akt通路受上游的Mfn-2影响[12]，但七氟醚影响的PI3K-AKT通路还受什么因素影响尚未知[13]。同时，测量指标中的cTn-I在人类中由心肌细胞受损后肌钙蛋白复合物释放入血明显升高一般在4 h～6 h后[14]，而大鼠心肌损伤后不到1 h即可差异性检出(P<0.05)，在第3小时就可达到高峰[15]，也体现了二者之间存在种属差异，甚至同在七氟醚关于大鼠某些细胞凋亡中，性别差异也会影响结果[16]。结合文献，正式实验之前的预实验证实了1MAC七氟醚的确有保护效果[17]，受实验规模限制，对于不同梯度浓度的七氟醚，保护有多大的差异性，还是未知。更重要的是心肌的缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡是一个比较长的过程[18]，本实验只进行了对早期的观察，后期的一些变化未能充分展示，七氟醚对整个凋亡过程的影响还需要深入挖掘。

[1] Bhushan S，Kondo K，Predmore BL，et al. Selective β2-adrenoreceptor stimulation attenuates myocardial cell death and preserves cardiac function after ischemia-reperfusion injury[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(8)：1865-1874．

[2] Hashmi S，Al-Salam S.Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury：a comparison[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8(8)：8786-8796.

[3] Cao JF，Xie H，Sun Y，et al．Sevoflurane post-conditioning reduces rat myocardial ischemia reperfusion injury through an increase in NOS and a decrease in phopshorylated NHE1 levels[J]. Int J Mol Med，2015，6(36)：1529-1537.

[4] Behne M，Wilke HJ，Harder S.Clinical pharmacokinetics of sevoflurane[J].Clinical Pharmacokinetics，1999，36(1)：13-26.

[5] 李献帅.线粒体融合蛋白 1、线粒体融合蛋白2与心肌细胞生理机能关系的研究进展[J].中国胸心血管外科临床杂志，2013，20(4)：457-462.

[6] Zhanga Y，Tianb SY，Lic YW，et al.Sevoflurane preconditioning improving cerebral focal ischemia-reperfusion damage in a rat model via PI3K/Akt signaling pathway[J]. Gene，2015，569(1)：60-65.

[7] 朱学敏，孟庆华.线粒体融合蛋白-2的功能[J].北京医学，2015，37(12)：1177-1179.

[8] Hall AR，Burke N，Dongworth RK，et al.The adult murine heart is protected against ischemia-reperfusion injury in the absence ofboth mitofusin (MFN) proteins[J].Heart，2014，4(100)：A22-A23.

[9] Ellis L，Ku SY，Ramakrishnan S，et al.Combinatorial antitumor effect of HDAC and the PI3K-AKT-mTOR pathway inhibition in a Pten defecient model of prostate cancer[J].Oncotarget，2013，4(12)：2225-2236.

[10] 姜威，王琳，楚东岭，等.不同潮气量机械通气过程中呼吸机相关性肺损伤的病理学变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(31)：6236-6238.

[11] 王彦，赵英男，邹丽琳，等.心肌缺血-再灌注损伤大鼠心电图变化机制的研究[J].大连医科大学学报，2010，32(2)：160-165.

[12] Chen KH，Guo XM，Ma DL，et al．Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell Biology，2004，9(6)：872-883.

[13] 武旖旎，韩新，樊理华.PI3K/Akt信号通路和自噬在七氟醚减轻阿霉素致大鼠心肌损伤中的作用[J].中华麻醉学杂志，2016，36(6)：728-731.

[14] 乔树洲，张明旭，刘丽华，等.老年陈旧性心肌梗死介入治疗后心肌标志物水平变化分析[J].中国全科医学，2010，13(17)：1912-1913.

[15] 卢均坤，初而复，李欣，等.SD大鼠电击损伤后心肌损伤与氧化应激关系的研究[J].临床心血管病杂志，2016，32(5)：513-516.

[16] Xie H，She GM，Wang C，et al.The gender difference in effect of sevoflurane exposure on cognitive function and hippocampus neuronal apoptosis in rats[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2015，4(19)：647-657.

[17] 黄艳，杨小霖，黄三.新生及成年大鼠七氟醚MAC值的测定[J].临床麻醉学杂志，2016，32(8)：803-805.

[18] Ziraldo R，Link N，Abrams J，et al.Towards automatic image analysis and assessment of the multicellular apoptosis process[J].Institution of Engineering and Technology，2015，9(5)：424-433.

(本文编辑郭怀印)

The Effects of Mfn-2 Expression and PI3K-Akt Signaling Pathway in Reduction of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury by Sevoflurane Postconditioning in Rats

Yang Chun，Fan Zhiqiang，Wang Jiangang，Tian Shouyuan，Jin Yiqiao，Li Xiang，Zhu Jian

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Fan Zhiqiang (Shanxi Boai Hospital，Taiyuan 030001，Shanxi，China)

Objective To research the protection function of myocardial ischemia-reperfusion injury by sevoflurane postconditioning in rats and the role of Mfn-2 expression and PI3K-Akt signaling pathway.Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups (n=6 earch)：group S，group MIRI，group SP，group SP+W，and group W. After anesthesia and fix the rats，except group S，the rest of the four groups would be ligation tight the left anterior descending branches for 30 minutes，then renew blood flow for 120 minutes. Group SP should inhale 2.3% sevoflurane for 15 minutes，when it is 10 minutes before the blood flow renewed. Group SP + W should be given a 15 μg/kg diluented Wortmannin for 1 mL by vein injection before inhalation. Group W was given the diluented Wortmannin only before the blood flow renewed.Then cTn -I was measured by ELISA.The total Akt，P - Akt and Mfn - 2 expression were measured by western blot.The ratio of the P - Akt and total Akt was calculated.The morphology changes of myocardial cell were observed under electron microscopy. Results The total Akt was closed in 5 groups，there was no statistically significant difference(P>0.05).Compared with group S，cTn -I and P-Akt/total Akt were increased statistically significantly in group MIRI，group SP，group SP+W，and group W(P<0.05). cTn-I in group SP was less than that in group MIRI，group SP+W，and group W(P<0.05). P-Akt and P-Akt/total Akt in group SP was more than that in group MIRI，group SP+W，and group W(P<0.05). There was no significant difference in aspects of cTn-I，P-Akt/total Akt among group SP+W，group MIRI and group W(P>0.05). Compared with group S，Mfn-2 were increased in the others(P<0.05). There was no significant difference in Mfn-2 between group SP and group SP+W(P>0.05).Neither the difference between group MIRI and group W，but the former two groups were smaller than the latter ones，there was a significant difference(P<0.05).It showed that there was no signs of damage in group S，while it shows a significantly damage lighter in group SP than other three groups with the electron microscope.Conclusion Sevoflurane postconditioning can alleviate myocardial ischemia-reperfusion injury in rats，probably via with the reduction of Mfn-2 expression and the activation of PI3K - Akt pathway，also，the former factor effects the latter one.

sevoflurane postconditioning；myocardial ischemia-reperfusion injury；Mfn-2；PI3K - Akt

山西省自然科学基金面上项目(No.2014011040-9)

1.山西医科大学(太原 030001)；2.山西博爱医院；3.山西医科大学第一医院

范志强，E-mail：fankm@163.com

信息：杨春，范志强，王建刚，等. 七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及对线粒体融合蛋白2表达和PI3K-Akt通路的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(10)：1174-1177.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.007

1672-1349(2017)10-1174-04

2016-12-01)