TGF-β受体1和p38MAPK在绵羊不同部位皮肤中的表达差异

曹校瑞，卢嘉茵，吴 琼，程笳琪，牛 姝，赫晓燕

(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)



TGF-β受体1和p38MAPK在绵羊不同部位皮肤中的表达差异

曹校瑞，卢嘉茵，吴 琼，程笳琪，牛 姝，赫晓燕*

(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

绵羊毛发的生长速度因部位的不同而存在差异，绵羊腹股沟及耳部的毛发生长速度慢，而背部的毛发生长速度快长。研究表明，多种因素会影响动物毛发的生长速度及其他性状，其中MAPK信号通路在皮肤发育及毛发生长过程中有一定的调控作用。应用免疫组织化学技术对TGF-β受体1及p38MAPK在绵羊背部、耳部以及腹股沟部皮肤的表达水平与定位进行研究，以探讨TGF-β受体1及p38MAPK与绵羊毛发生长发育的关系。结果显示，TGF-β受体1及p38MAPK在绵羊的背部、耳部与腹股沟部均有表达，且p38MAPK在背部表达量最多，耳部次之，腹股沟部最少；而TGF-β受体1在耳部毛囊中的表达量最高，腹股沟部次之，在背部毛囊中的表达量最低。研究结果提示，TGF-β受体1及p38MAPK可能与绵羊毛发的生长发育有关。

TGF-β受体1；p38MAPK；绵羊；不同部位；生长发育

动物皮毛的生长极为复杂，受到遗传、外界环境、代谢、营养等各种因素的影响[1-2]。遗传因素作为皮毛生长的决定性因素，许多基因都直接或者间接的影响动物毛发生长，目前发现200多种因子会影响绵羊的毛发生长，如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic,BMP)、WNT(wingless-relatedMMTV integration site WNT)、成纤维生长因子(fibroblast growth factors,FGF)、神经因子(neurotrophins)、β-catenin、EDA/EDAR、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[3-5]。其中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它存在于大多数真核细胞中，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内并引起细胞反应的一类重要的信号通路，从而影响细胞的生长、增殖和分化，对动物毛发的生长和发育有着重要的作用[6]。TGF-β受体1是单次跨膜糖蛋白，属丝/苏氨酸激酶受体家族，由胞外区、跨膜区及胞内区等3个部分组成，是TGF-β信号转导的主要受体，其活化是TGF-β信号转导的起点，在MAPK信号转导通路中处于核心地位，进而调控细胞周期，影响细胞生长、增殖、分化、黏附、迁移和凋亡等过程[7]。p38MAPK于1993年由Brewster等发现，Han等用高渗和内毒素刺激小鼠肝脏细胞，分离纯化出分子质量为38 ku的酪氨酸磷酸化蛋白激酶——p38 MAPKs，目前的研究发现，p38MAPK参与了应激反应，并且在细胞凋亡、分化、增殖等方面扮演重要的角色，同时也参与炎症反应，研究发现P38MAPK在细胞生长周期的调控中发挥了重要的作用[8]。由文献可知，绵羊不同部位毛发的生长速度存在明显差异，耳部、腹股沟部毛发生长速度慢而背部毛发生长速度快[9],但TGF-β受体1和p38MAPK是否与绵羊不同部位的生长速度有关还不清楚。

本试验采用同等条件下饲养3岁白色绵羊作为研究对象，利用免疫组织化学方法观察TGF-β受体1和p38MAPK生长因子在绵羊耳部、背部以及腹股沟部皮肤的分布，以探讨TGF-β受体1和p38MAPK对绵羊毛发生长发育的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物及取材 白色绵羊3只(编号①，②，③)，将其腹股沟部、耳部、背部剃毛后，用取皮器分别取其一块组织样品，立即将其置于Bouin氏固定液中，24 h后，通过洗涤、梯度酒精脱水、二甲苯透明、透蜡、包埋、修块、切片、展片、贴片，制成7 μm厚的组织切片，用于免疫组织化学分析。

1.1.2 主要试剂与耗材 兔Streptavidin-HRP试剂盒(康维世纪)，兔抗p38MAPK抗体(bs-0637R，abcam)，兔抗 TGF-β受体1抗体(bs-0637R，abcam)，苏木精，中性树脂，梯度酒精，二甲苯，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠等。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片的制备 常规方法制片，片厚7 μm。组织修整→脱水、透明→浸蜡→包埋→修块→切片、展片、烤片，做好标记，放入切片盒备用。

1.2.2 免疫组织化学试验 采用免疫组化试剂盒，按说明书进行试验。切片脱蜡与复水→封闭→滴加一抗(分别滴加兔抗p38MAPK抗体、兔抗 TGF-β受体1抗体)→孵育→PBS缓冲液冲洗→滴加二抗→PBS缓冲液冲洗→滴加SABC→PBS缓冲液冲洗→DAB显色→苏木精染色→封片，采集图像，每个样品取6张切片，每张切片选取5个视野。

1.2.3 图像采集与数据分析 使用图像分析软件Image-proplus6.0，对制成的切片进行观察并进行光密度测试，对每张切片采集的5个视野进行测试，得出每个样品的阳性反应平均光密度值。使用SPPS17.0软件进行数据分析，通过描述统计表分析得到每组值的均值和标准偏差，进行方差分析。

2 结果

2.1 TGF-β受体1在绵羊皮肤中的表达

结果显示，TGF-β受体1阳性免疫反应物在绵羊耳部、背部、腹股沟部的皮肤毛囊中都有存在，而且分布在在外毛根鞘及其周围更广泛的区域,并且耳部表达最为明显，背部和腹股沟部次之(图1)。

2.2 p38MAPK在绵羊皮肤中的表达

结果显示，p38MAPK阳性免疫反应物在绵羊耳部、背部、腹股沟部的皮肤毛囊中都有存在,而且在结缔组织中也有表达,并且背部表达最为明显，耳部和腹股沟次之(图2)。

2.3 图像分析及统计结果

分别将TGF-β受体1及 p38MAPK表达在绵羊1、绵羊2、绵羊3的背部、腹股沟部和耳部组织中的情况利用图像分析软件和Spss软件进行分析(表1)。

表中数据表示TGF-β受体1和p38MAPK在绵羊背部、耳部、腹股沟部的光密度平均值±标准差(mean±SD)，不同的字母表示在统计分析结果中，其数值不在同一列，表示差异显著，相同字母表示差异不显著。

3 讨论

羊毛的生长基础是毛囊，众多研究显示，与毛囊生长发育有关的200多种分子中，MAPK信号转导途径占到分子总数的19.53%[10]。研究显示，MAPK与褪黑素存在着较为复杂的关系，赵德超等在进行褪黑素埋植试验中检测并发现，在诸多因子中，MAPK受褪黑素的影响最大[11]。1983年，Rose等通过埋植褪黑素诱发水貂冬毛提早生长，后来的一些学者经过努力研究，证明了褪黑素确实能诱导例如小鼠及安哥拉兔等提早生毛,证明褪黑素可以调节动物毛发的生长；常子丽等通过持续埋植褪黑发现持续埋植褪黑素对羔羊粗毛有变细的趋势，而且有增加产绒量的趋势，促使毛发提前生长。而TGF-β受体1及p38MAPK作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成员，同时也参与了褪黑素在某些疾病中的作用机制。TGF-β通路参与众多生理生化过程，已有研究表明在动物毛囊发育和被毛生长过程中，TGF-β相关因子等参与了调控。TGF-β受体1是通路中的Ⅰ型受体，来自细胞外的信号分子与TGF-βRⅡ结合后，使得TGF-β受体1发生磷酸化并且形成四聚体，将信号传导至细胞，调节细胞的生理活动，进而影响动物毛发的生长发育。p38MAPK作为一种重要的信号通路，能够迅速地对外界的刺激作出反应，并及时与其他信号通路共同合作，避免机体的损伤。同时以上的讨论也提示我们，p38MAPK也可能是影响毛囊生长发育的一个因子，鉴于它与褪黑素之间的关系以及目前的研究，p38MAPK可能对动物毛发的生长发育有着较大影响。由文献推测，TGF-βRI及p38MAPK可能是影响毛囊生长发育的重要因子。

A1、B1、C1.分别表示绵羊耳部、腹股沟部和背部的阳性结果; a1、b1、c1.分别表示绵羊耳部、腹股沟部和背部的阴性结果

A1,B1,C1.Respectively represent the positive results of sheep ear,groin and back; a1,b1,c1. Respectively represent the negative results of sheep ear,groin and back

1.毛母质细胞;2.内根鞘;3.外根鞘

1.Hair matrix cell;2.Inner root sheath; 3.Outer root sheath

图1 TGF-β受体1在绵羊1耳部、背部和腹股沟部皮肤中的表达情况

Fig.1 Expression of TGF-β R1 in 1 sheep ears,back and groin skin

前期观察发现，绵羊背部的毛发生长速度最快，而腹股沟部的毛发生长速度次之，耳部的毛发生长速度最慢。本试验中，TGF-β受体1及p38MAPK在绵羊背部、耳部及腹股沟部均有表达，但表达量存在明显差异。TGF-β受体1在耳部的相对表达量高于腹股沟部，腹股沟部的表达量高于背部，TGF-β受体1与毛发的生长呈负相关，提示TGF-β受体1可能抑制了毛发的生长。p38MAPK在绵羊背部的表达量高于耳部，耳部的表达量高于腹股沟部，p38MAPK与绵羊毛发的生长速度呈正相关，表达量越多，毛发生长速度越快，反之越慢，提示p38MAPK可能促进毛发的生长。而TGF-β受体1与p38MAPK对毛发生长的确切作用、二者在毛发生长调控中是否存在相互关系等还有待于后续研究的证明。

免疫组织化学研究结果显示，TGF-β受体1在绵羊耳部的表达量最多，腹股沟部次之，背部最少，TGF-β受体1与毛发的生长呈负相关，提示TGF-β受体1可能抑制毛发生长；而p38MAPK在绵羊背部的表达量最多，耳部次之，腹股沟部最少，p38MAPK与绵羊的毛发生长呈正相关，提示p38MAPK可能促进毛发的生长。

A2、B2、C2.分别表示绵羊耳部、腹股沟部和背部的阳性结果;a2、b2、c2.分别表示绵羊耳部、腹股沟部和背部的阴性结果

1.毛乳头;2.毛母质;3.内根鞘;4.外根鞘;5.皮脂腺

A2,B2,C2.Respectively represent the positive results of sheep ear,groin and back; a2,b2 and c2. Respectively represent the negative result of sheep ear,groin and back

1.Hair papilla hair matrix; 2.Inner root sheath; 3.Inner root sheath; 4.External root sheath; 5.Sebaceous gland

图2 p38MAPK在绵羊1耳部、背部和腹股沟部皮肤中的表达情况

Fig.2 Expression of p38MAPK in 1 sheep ears,back and groin skin

表1 TGF-β受体1及p38MAPK在3只绵羊背部、耳部、腹股沟部的平均光密度值

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Differential Expressions of TGF-βR1 and p38MAPK in Different Part of Sheep Skin

CAO Xiao-rui1,LU Jia-yin1,WU Qiong1,CHENG Jia-qi1,NIU Shu1,HE Xiao-yan1
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu，Shanxi，030801,China)

There are differences on hair growth and development in the different parts of sheep.The hairs in groin and ear grow slowly.However,the back hairs grow fast.Some study showed that a lots factors influence animal hair growth speed and other structure characteristics,and MAPK signal pathway has a regulatory role in the development of skin and hair growth process,which TGF-βR1and p38MAPK have very important promote faction to the sheep hair growth.In order to explore the relationship between TGF-βR1,p38MAPK and sheep hair growth,the expression levels and localization of TGF-βR1and p38MAPK in skin hair follicle of sheep’s back ,ear and groin were examined by immunohistochemical technique.The results showed that TGF-βR1 and p38MAPK proteins were expressed in the sheep’ back,ear and groin,and the back up to the amount of p38MAPK expression,followed by ear,groin was the least,but the exprestsion of TGF-βR1in the ear hair follicles in the inguinal area was the highest,the lowest expression in the hair follicle of the back.The results suggested that TGF-βR1and p38MAPK may be related to the growth and development of sheep hair.

TGF-βR1; p38MAPK; sheep; differnt parts; growth and development

2016-10-24

国家自然科学基金项目(31172283)

曹校瑞(1993-)，男，山西翼城人，硕士研究生，主要从事动物毛发生长分子机制研究。*通讯作者

S852.16

A

1007-5038(2017)06-0024-05