红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺优化及抗氧化活性研究

邓春梅，何兰珍，张国光，李思东，温燕梅，吴育廉，黄灯威，康信煌

(广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088)



红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺优化及抗氧化活性研究

邓春梅，何兰珍，张国光，李思东，温燕梅，吴育廉，黄灯威，康信煌*

(广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088)

通过正交实验对红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺进行优化，用Sevage试剂脱蛋白并纯化多糖，用DPPH 自由基清除能力和总抗氧化能力评价多糖的体外抗氧化活性。结果表明，红树林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取工艺为：提取温度75 ℃、提取时间3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此条件下，多糖提取率达到3.14%；在实验浓度范围内，多糖清除DPPH自由基的能力及总抗氧化能力与其浓度呈正相关关系。表明红树林土曲霉GX7-3B多糖是一种天然抗氧化剂。

红树林；土曲霉；多糖；提取；抗氧化活性

红树林是生长于热带、亚热带海岸滩涂上的特殊森林植物，是陆地向海洋过渡的特殊生态系，兼具海洋与陆地的性质[1-2]，具有丰富独特的真菌资源。红树林共附生真菌能产生许多药用活性次级代谢产物，是崛起的一类新型药用真菌[3-8]。作者[9-10]前期研究发现，红树林土曲霉GX7-3B能产生具有抗肿瘤活性的次级代谢产物以及新的活性化合物。在此基础上，作者进一步提取其中的多糖，对提取工艺进行优化并研究多糖的体外抗氧化活性，以期扩大红树林土曲霉GX7-3B的药用范围、提高其药用价值。

1 实验

1.1 菌种、试剂与仪器

红树林土曲霉GX7-3B：GenBankID为KC461499。

蒽酮、丙酮、浓硫酸、30%双氧水等均为国产分析纯试剂，市售。

80-2B型离心沉淀机，江苏新康医疗器械有限公司； 722S型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司； 电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备公司；旋转蒸发器，上海亚荣生化设备公司；小型粉碎机；水浴摇床；三用恒温水箱。

1.2 菌种的培养

将红树林土曲霉GX7-3B接种于GPY培养基上，于25 ℃恒温培养28d，过滤，分离菌体与培养液；将菌体在甲醇中浸泡清洗3次后取出，自然晾干，待用。

1.3 多糖的提取与纯化

红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取与纯化工艺：菌体粉碎→热水提取→旋转浓缩→加入95%乙醇，冰箱静置过夜→离心→干燥→粗多糖→溶解→Sevage法[11]脱蛋白→离心→取上清液→加95%乙醇，冰箱静置过夜→离心→干燥→多糖。

1.4 多糖提取率的计算

参照文献[12]，采用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线；测定多糖溶液在490nm处吸光度(A490)，依标准曲线计算多糖含量，再按式(1)计算多糖提取率。

(1)

式中：D490为多糖含量；n为提取液稀释倍数；V为提取液的体积；m为菌体质量。

1.5 多糖抗氧化活性评价

1.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

用移液枪取2.8 mL 1.0 mg·mL-1多糖溶液于24孔板中；再用移液枪从中移取1.4 mL多糖溶液于下一个孔中，加蒸馏水1.4 mL，混匀；再从中取1.4 mL多糖溶液于下一个孔中，按此法稀释得到5个梯度浓度多糖溶液，每个浓度做3个平行，空白对照为1.4 mL蒸馏水与1.4 mL无水乙醇混合液；然后用移液枪取1.4 mL 0.2 μmol·L-1DPPH溶液于多糖溶液及空白对照中，快速混匀，在黑暗中反应30 min后测定517 nm处吸光度，按式(2)计算清除率。

(2)

式中：A0为无水乙醇+DPPH溶液的吸光度；A1为多糖+DPPH溶液的吸光度。

1.5.2 总抗氧化能力的测定

称取6.1 mg FeSO4，配成水溶液；加入0.25 mL 18 mol·L-1H2SO4，定容后放入还原铁；取5.00 mL上述冷却溶液于50 mL容量瓶中，再加入蒸馏水配制成800 μmol·L-1FeSO4标准溶液；继续用蒸馏水稀释，制备25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1FeSO4标准溶液，测定593 nm处吸光度，绘制FeSO4标准曲线；采用FRAP法[13]测定总抗氧化能力。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标、吸光度(A490)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

从图1可以看出，葡萄糖浓度在0.1～0.5 mg·mL-1范围内与A490呈线性关系。回归方程为y=1.059x-0.0167,R2=0.9988。

2.2 多糖提取工艺优化

在单因素实验的基础上，综合多糖提取过程中各个单因素的相互关系，以提取温度、提取时间及料液比为考察因素，以多糖提取率为评价指标，采用L9(34)正交实验优化多糖提取工艺。正交实验因素与水平见表1，结果与分析见表2。

由表2可知，各因素对多糖提取率的影响大小为：C>B>A，即影响最大的是料液比，其次是提取时间，提取温度影响最小，最优提取条件为A1B1C1，即提取温度75 ℃、提取时间3 h、料液比1∶30(g∶mL，下同)，在此条件下，多糖提取率达到3.14%。

表1 正交实验的因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交实验结果与分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

2.3 多糖的抗氧化活性评价

2.3.1 对DPPH自由基的清除能力

处于DPPH自由基中心位置的氮原子上的单电子对517 nm波长有强吸收，使得DPPH自由基醇溶液呈紫色。当存在自由基清除剂时，醇溶液褪色的程度与氮原子上单电子接受的电子数目呈剂量关系。本实验参照文献[14]，采用紫外分光光度法测定了多糖对DPPH自由基的清除能力，结果如图2所示。

从图2可以看出，随着多糖浓度的增大，DPPH自由基清除率逐渐升高。表明，土曲霉GX7-3B多糖对DPPH自由基的清除能力与其浓度呈正相关关系。

2.3.2 总抗氧化能力

人体自由基的量在代谢正常的情况下是处于一种动态平衡中，当外界环境(如太阳光的辐射、吸入污染的气体、吸烟等)发生变化时，这种动态平衡极易被破坏，导致自由基积累，伤害人体正常组织，甚至引发肿瘤、心脏病和老年痴呆等。为了防止和减轻自由基造成的损害，需要合适的自由基清除剂。研究显示[15-16]，大多数真菌多糖能通过增强谷胱甘肽过氧化物酶活性来清除自由基。为此，本实验采用FRAP法研究红树林土曲霉GX7-3B多糖的总抗氧化能力，FeSO4标准曲线见图3，多糖总抗氧化能力见图4。

图2 多糖对DPPH自由基的清除能力

图3 FeSO4标准曲线

图4 多糖的总抗氧化能力

从图4可以看出，在实验浓度范围内，当多糖浓度每增加一倍，总抗氧化能力会显著增强(P<0.01)；当多糖浓度达到最大，即1 mg·mL-1时，FRAP值可以达到103.2，总抗氧化能力最强。表明，红树林土曲霉GX7-3B多糖的总抗氧化能力与其浓度呈正相关关系。

3 结论

通过正交实验确定红树林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取条件为：提取温度75 ℃、提取时间3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此条件下，多糖提取率达到3.14%。红树林土曲霉GX7-3B多糖清除DPPH自由基的能力和总抗氧化能力与其浓度呈正相关关系。表明，红树林土曲霉GX7-3B多糖是一种较好的天然抗氧化剂，具有开发成为药物或功能食品的潜力。

[1] 林鹏.中国红树林生态系[M].北京：北京科学出版社,1997：167.

[2] LIN P.Mangrove Ecosystems in China[M].Beijing and New York：Science Press，1999:142-167.

[3] 丘柳明，左文健，王辉.角果木内生真菌Penicilliunsp．J54 代谢产物及活性研究[J].中国海洋药物，2015，34(2)：17-21.

[4] HUANG C H，PAN J H，CHEN B，et al.Three bianthraquinone derivatives from the mangrove endophytic fungusAlternariasp.ZJ9-6B from the South China Sea[J].Marine Drugs，2011，9：832-843.

[5] XUE C B，WANG A L，MELONI D，et al.Discovery of INCB3344，a potent，selective and orally bioavailable antagonist of hunman and murine CCR2[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2010,20(24):7473-7478.

[6] HUANG Z，CAI X，SHAO C，et al.Chemistry and weak antimicrobial activities of phomopsins produced by mangrove endophytic fungusPhomopsissp.ZSU-H76[J].Phytochemistry,2008，69(7):1604-1608.

[7] XU J，KIER J，SENDKER J，et al.Cytosporones，coumarins，and an alkaloid from the endophytic fungusPestalotiopsissp.isolated from the Chinese mangrove plantRhizophoramucronata[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry,2009，17(20):7362-7367.

[8] 胡谷平,佘志刚,吴耀文,等.南海海洋红树林内生真菌胞外多糖的研究[J].中山大学学报(自然科学版),2002，41(1):121-122.

[9] DENG C M，LIU S X，HUANG C H,et al.Secondary metabolites of a mangrove endophytic fungusAspergillusterreus(No.GX7-3B) from the South China Sea[J].Marine Drugs，2013，11(7):2616-2624.

[10] DENG C M，HUANG C H，WU Q L,et al.A new sesquiterpene from the mangrove endophytic fungusAspergillusterreus(No.GX7-3B)[J].Natural Product Research，2013，27(20)：1882-1887.

[11] 王思芦，汪开毓，彭艳伶.野生鸡枞菌多糖的提取及其免疫活性[J].中国兽医科学，2011,41(12):1276-1281.

[12] 郑必胜，唐芳勇，闫文娟，等.苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量的研究[J].农产品加工·学刊，2008(8):17-21.

[13] 赵文恩，李茜倩.FRAP法测定大枣枣皮红色素的总抗氧化能力[J].郑州大学学报(工学版)，2011,32(3):29-30.

[14] 罗萍，师莉莎，刘华忠.乌贼墨多糖的体外抗氧化作用[J].食品研究与开发，2013,34(8):1-4.

[15] HUA Y L,YANG B,TANG J,et al.Structural analysis of water-soluble polysaccharides in the fruiting body ofDictyophoraindusiataand theirinvivoantioxidant activities[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(1)：343-347.

[16] WANG Q,LI H,CHEN T T,et al.Yield，polysaccharides content and antioxidant properties ofPleurotusabalonusandPleurotusgeesteranusproduced on asparagus straw as substrate[J].Scientia Horticulturae,2012,134：222-226.

打击非法集资 共创社会和谐

——《化学与生物工程》编辑部

Optimization on Extraction Process of Polysaccharides from Mangrove EndophyticAspergillusterreusGX7-3B and Their Antioxidant Activity

DENG Chun-mei,HE Lan-zhen,ZHANG Guo-guang,LI Si-dong,WEN Yan-mei,WU Yu-lian,HUANG Deng-wei,KANG Xin-huang*

(SchoolofChemistryandEnvironment,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang534088,China)

TheextractionprocessofpolysaccharidesfrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasoptimizedthroughanorthogonalexperiment.ThepolysaccharideswerepurifiedbydeproteinizationusingSevagereagent.Theantioxidantactivityin vitrowasevaluatedbythescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantability.Resultsindicatedthattheoptimumextractionconditionsofpolysaccharideswereasfollows:extractiontemperatureof75 ℃,extractiontimeof3h,solid-liquidratioof1∶30(g∶mL).Theextractionrateofpolysaccharidesreached3.14%underaboveconditions.ThescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantabilityshowedapositiverelationshipwiththeconcentrationofpolysaccharidesinrangeoftestingconcentrations,whichsuggestedthatpolysaccharidefrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasanaturalantioxidant.

mangrove;Aspergillus terreus;polysaccharide;extraction;antioxidantactivity

湛江市科技局自然科学基金项目(A15445，A14457)，广东海洋大学自然科学基金项目(E13503，Q14176)

2016-12-15

邓春梅(1968-)，女，江西南昌人，博士，高级实验师，研究方向：天然药物化学，E-mail：dcm2382405@163.com；通讯作者：康信煌，副教授，E-mail：kang.xinhuang@gmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.009

O636.1 R931

A

1672-5425(2017)06-0041-04

邓春梅，何兰珍，张国光，等.红树林土曲霉GX7-3B多糖的提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].化学与生物工程，2017，34(6)：41-44.