QCM实时监测人脐静脉内皮细胞在不同KRGD浓度自组装膜上的动态粘附

熊 伦,周铁安*,黄复深，沈海波，黄靓圆

(1.湖南农业大学 细胞力学与生物传感研究所，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)



QCM实时监测人脐静脉内皮细胞在不同KRGD浓度自组装膜上的动态粘附

熊 伦1,2,周铁安1,2*,黄复深1,3，沈海波1,2，黄靓圆1,2

(1.湖南农业大学 细胞力学与生物传感研究所，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

采用自组装及化学耦合技术将细胞粘附分子KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)与3-巯基丙酸(MPA)以及防止细胞非特异性粘附的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚(TGME)修饰于石英晶体微天平(QCM)的金电极上，制备了KRGD-MPA/TGME/Au传感界面；采用QCM实时监测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在不同KRGD浓度(0 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)自组装膜上的动态粘附过程。结果表明，当KRGD浓度为50 μg·mL-1时，QCM频率变化Δf、动态电阻变化ΔR、细胞黏弹性指数CVI(ΔR/Δf)最大，表明该条件下HUVEC在QCM表面的粘附最强，显示出最有组织的细胞骨架结构而最硬；当加入肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin后，粘附有细胞的QCM响应信号减弱，细胞粘附变弱，细胞变软。表明QCM可用于监测不同KRGD浓度自组装膜上HUVEC的动态粘附及细胞-药物作用，从而提供有关细胞粘附强度与黏弹性的动态信息。

人脐静脉内皮细胞；细胞粘附；细胞黏弹性；石英晶体微天平；KRGD；blebbistatin

石英晶体微天平(QCM)是一种基于压电效应的应用广泛的非标记生物传感器，具有操作简便、灵敏度和精确度高等优点[1]，在测量细胞力学性能方面具有非常好的前景。Wu等[2]用QCM比较了年老与年轻腱干细胞的黏弹性，发现年老细胞的硬度与黏度较年轻细胞大[3]。Li等[4]研究证明，QCM可以有效地用作功能生物传感器来确定活细胞的黏弹性。Zhou等[5-6]用QCM实时监测细胞的粘附过程时发现，对癌症与心血管疾病的治疗或病理研究可以通过癌细胞和心肌细胞的粘附过程及其黏弹性变化来反映。

细胞粘附过程是动态的，且能反映微环境变化对细胞的影响，是研究复杂活细胞系统最好的模型之一。事实上，在许多生理和病理条件下，细胞粘附过程在很多生物过程(如细胞形态、生长发育、免疫反应、癌变等)中起着十分重要的作用[7]。细胞粘附过程也是一个力传感的过程，涉及细胞和基质之间的相互作用力，反映活细胞的黏弹性变化，细胞对力信号的敏感过程是通过细胞外基质、跨膜整合素受体、细胞骨架结构和相关的信号分子所介导的[8-9]。

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的RGD多肽是整合素与细胞外基质表面配体蛋白相互作用的识别位点，在促进细胞粘附和细胞增殖等方面起着重要作用[10]，但关于RGD浓度如何影响细胞粘附过程的黏弹性变化鲜有报道。在QCM等细胞传感器的相关研究中，核心技术是如何将细胞有效地固定于传感界面上。细胞传感界面的优化是制备具有优良性能细胞传感器的核心技术。已有报道将RGD固定于QCM传感界面用于细胞粘附研究[11-12]，但在促进细胞粘附过程的同时未考虑抑制细胞的非特异性粘附。此前，周铁安课题组[13]采用自组装技术将细胞粘附分子RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys)和防止细胞非特异性粘附的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚(TGME)修饰于金电极表面，制备了致密、稳定、对大鼠心肌H9C2细胞具有特异性粘附的传感界面。

KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)是在RGD的一端连接了一个含氨基的赖氨酸，氨基端可经酰胺化共价耦合与3-巯基丙酸(MPA)中的羧基相连，另一端的RGD则可与细胞产生粘附作用。鉴于此，作者采用KRGD对QCM金电极表面进行修饰，首先将MPA与TGME混合后自组装于QCM金电极表面，之后通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)将MPA中的羧基与KRGD中含有氨基的赖氨酸经化学耦合而将KRGD固定在金电极上，制备了KRGD-MPA/TGME/Au传感界面，研究不同KRGD浓度对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)动态粘附与黏弹性的影响；然后在最佳KRGD浓度下，用QCM实时监测肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin对HUVEC动态粘附的影响，以推动细胞传感技术的进一步发展。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

HUVEC，上海通派生物科技有限公司；DMEM培养基；胎牛血清；浓硫酸、30%双氧水、无水乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；TGME、MPA、EDC、NHS，美国Sigma公司；KRGD，上海生工；青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液，Life Technologies；磷酸盐缓冲溶液(PBS)；Millipore Milli-Q超纯水。

QCM 922型八通道石英晶体微天平、9 MHz AT切型金电极石英晶体(基底直径8 mm，电极直径5 mm)，Seiko-EG&G公司；CO2培养箱，德国Binder公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培养

HUVEC贴壁培养于10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基中，培养条件为5%CO2、37 ℃。一般2～3 d传代一次。

1.2.2 金电极的预处理

将金电极先用无水乙醇、去离子水清洗，氮气吹干；然后用Piranha溶液(30%H2O2∶H2SO4=1∶3，体积比，80 ℃)处理30 s；再用去离子水、无水乙醇清洗，氮气吹干；重复3次。将无水乙醇滴到金电极上静置几分钟，用灭菌水冲洗，氮气吹干，备用。

1.2.3 KRGD-MPA/TGME/Au传感界面的制备及用于HUVEC的粘附

KRGD-MPA/TGME/Au传感界面的制备在常温(20±5) ℃下进行。将预处理过的金电极组装到Teflon井型池中，清洗的一面与Teflon井型池中的溶液接触，另一面与O型橡胶圈接触，与Teflon井型池底部形成一空气室。连接QCM 922通道，置于20 mmol·L-1MPA+1 mmol·L-1TGME(无水乙醇为溶剂)溶液中，过夜(约15～24 h)，吸出溶液，将无水乙醇轻轻打进井型池中，吸出无水乙醇后，用Millipore Milli-Q超纯水轻轻冲洗，氮气吹干。将150 mmol·L-1EDC、30 mmol·L-1NHS(pH=5.5)溶液加入池中，浸泡约60 min后依次用PBS缓冲溶液(pH=5.5)、Millipore Milli-Q超纯水冲洗，氮气吹干。取200 μL浓度(μg·mL-1)分别为0、25、50、75、100的KRGD溶液(PBS为溶剂)加入到金电极表面，静置1～2 h，得到不同KRGD浓度的KRGD-MPA/TGME/Au传感界面。

用PBS缓冲溶液、灭菌水轻轻冲洗，氮气吹干；加入200 μL HUVEC(约20 000个细胞)。开启QCM

实时监测HUVEC在KRGD-MPA/TGME/Au传感界面上的动态粘附过程中(0～15 h)的频率变化(Δf)与动态电阻变化(ΔR)。

1.2.4 药物响应

用肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin研究KRGD-MPA/TGME/Au传感界面的药物响应。在KRGD-MPA/TGME/Au (KRGD浓度为50 μg·mL-1) 传感界面粘附好20 000个HUVEC得到稳定响应曲线后，向各通道中同时加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin，继续监测其Δf和ΔR，直到响应曲线再次趋于稳定为止。

2 结果与讨论

2.1 不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对HUVEC粘附过程中Δf和ΔR的影响

选用5种不同KRGD浓度(0、25、50、75、100，μg·mL-1)的KRGD-MPA/TGME/Au传感界面，比较KRGD浓度对20 000个HUVEC粘附过程中Δf和ΔR的影响，结果如图1所示。

图1 不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对HUVEC粘附过程中Δf(a)和ΔR(b)的影响

从图1可以看出，在不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面上，HUVEC粘附过程中的Δf和ΔR由小到大的顺序依次为：0 μg·mL-1<20 μg·mL-1<100 μg·L-1<75 μg·mL-1<50 μg·mL-1，表明KRGD浓度为50 μg·mL-1时，KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对HUVEC的粘附最强。

2.2 不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对HUVEC粘附过程中黏弹性指数(CVI)的影响

细胞黏弹性是与细胞结构与功能密切相关的重要生物物理特性，其大小主要由细胞骨架决定，在细胞生长、分化等过程中起着重要作用。用于单细胞黏弹性

参数的研究方法较多，如原子力显微镜(AFM)已被用于不同细胞(包括内皮细胞)硬度的测定[14]。用于细胞群黏弹性测定的方法较为缺乏，QCM由于其无损、动态监测、且可从细胞与细胞外基质粘附界面处研究细胞群的平均黏弹性等特征而成为细胞群黏弹性研究的重要方法。

本实验采用细胞黏弹性指数CVI(ΔR/Δf)来表征细胞的黏弹性，CVI越大，细胞骨架的组织程度越高、细胞越硬；CVI越小，细胞越软[5]。不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对20 000个HUVEC粘附过程中CVI的影响如图2所示。

图2 不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面对HUVEC粘附过程中CVI的影响

由图2可以看出，当KRGD浓度为50 μg·mL-1时，CVI最大，而后依次为75 μg·mL-1、100 μg·

mL-1、25 μg·mL-1，最小为0 μg·mL-1(即裸电极)，与Δf及ΔR变化规律一致。

2.3 blebbistatin对QCM实时监测HUVEC粘附过程的影响

肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin是小分子抑制剂的一种，它能与肌球蛋白和ADP-Pi复合体优先结合，从而减少磷酸根的释放[15]。blebbistatin可以抑制哺乳动物动脉平滑肌[16]，阻断肌动蛋白分离状态下的肌球蛋白Ⅱ和防止僵化肌动球蛋白交联的特性是其体内应用的一个很大的优势[17]。因此，本实验研究了blebbistatin对QCM实时监测HUVEC粘附过程的影响。待20 000个HUVEC粘附在KRGD-MPA/TGME/Au(KRGD浓度为50 μg·mL-1)上达到平稳后(约24 h)，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin来研究其对HUVEC粘附过程的影响，结果如图3所示。

图3 blebbistatin对QCM实时监测HUVEC粘附过程的影响

从图3a可以看出，在KRGD浓度为50 μg·mL-1的KRGD-MPA/TGME/Au传感界面上加入20 000个HUVEC后，Δf逐渐降低，ΔR逐渐升高，表明HUVEC粘附在了KRGD-MPA/TGME/Au传感界面上；待曲线趋于稳定后，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin(最终浓度为1.22 μmol·L-1)，QCM响应信号减弱，Δf上升，ΔR下降。

从图3b可以看出，在blebbistatin作用下，CVI减小，吸附变弱、细胞变软，与Tarantola等[18]研究的加入blebbistatin后细胞软化的结论一致。

2.4 讨论

本实验采用自组装及化学耦合技术将KRGD与MPA、TGME修饰于QCM金电极上，制备了5种不同KRGD浓度的KRGD-MPA/TGME/Au传感界面，通过QCM实时监测HUVEC在传感界面上的Δf、ΔR及CVI。当KRGD浓度为50 μg·mL-1时，Δf、ΔR、CVI最大，其次为75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、25 μg·mL-1，最小为0 μg·mL-1(即裸电极)。因此可认为当KRGD浓度为50 μg·mL-1时，HUVEC与KRGD-MPA/TGME/Au传感界面有很强的粘附作用并使HUVEC得以顺利铺展，粘附效果最佳，表明细胞应力纤维量最多，所搭建的细胞骨架结构最稳定、细胞最硬。这可能是由于在较高KRGD浓度(75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)下，HUVEC与KRGD-MPA/TGME/Au传感界面的粘附作用由于KRGD的取向受空间位阻影响较50 μg·mL-1KRGD浓度下有所减弱，较裸电极和25 μg·mL-1KRGD浓度下强很多，故Δf、ΔR、CVI处于中间值；与文献[19]研究的当RGD浓度超过一定值后对细胞已不具备特异性粘附能力的结论一致。

QCM生物传感器可用于检测细胞骨架改变和动力学，并且可以对受到细胞骨架扰动或细胞附着影响的生物活性药物或生物大分子进行有价值的筛选[1,20]。本实验发现，KRGD-MPA/TGME/Au传感界面粘附HUVEC后，在blebbistatin的作用下，细胞黏弹性减小、细胞变软、与传感界面之间的粘附作用减弱。

3 结论

用QCM实时监测HUVEC在不同KRGD浓度KRGD-MPA/TGME/Au传感界面上的动态粘附过程以及加入肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin后的响应变化。结果表明，当KRGD浓度为50 μg·mL-1时，QCM频率变化Δf、动态电阻变化ΔR、细胞黏弹性指数CVI(ΔR/Δf)最大，表明该条件下HUVEC在QCM表面的粘附最强、显示出最有组织的细胞骨架结构而最硬；当加入肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin后，粘附有细胞的QCM响应信号减弱，细胞粘附变弱、细胞变软。

本实验所构建的KRGD-MPA/TGME/Au传感界面可以达到保持细胞活性和稳定性的效果，能够防止细胞的非特异性粘附。通过不同浓度KRGD修饰的传感界面对细胞粘附效果的对比实验，获得了最佳KRGD浓度，确保传感界面对细胞运动和结构变化等有较高的灵敏度。细胞黏弹性等关键信息可用于量化药物的影响、突变或疾病细胞的结构分析。该研究对推动细胞传感技术的进一步发展及应用于药物筛选和评估领域具有积极意义。

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Real-Time Monitoring of Dynamic Adhesion of Human Umbilical Vein Endothelial Cells on Self-Assembled Films with Different KRGD Concentrations Using Quartz Crystal Microbalance

XIONG Lun1,2,ZHOU Tie-an1,2*,HUANG Fu-shen1,3,SHEN Hai-bo1,2，HUANG Jing-yuan1,2

(1.InstituteofCellMechanicsandBiosensing,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

CelladhesionpeptideKRGD(Lys-Arg-Gly-Asp),3-mercaptopropionicacid(MPA)andTGMEwhichpreventednon-specificadhesionweremodifiedonquartzcrystalmicrobalance(QCM)Auelectrodebyself-assemblyandchemicalcoupling,andKRGD-MPA/TGME/Ausensinginterfacewasprepared.QCMwasusedforreal-timemonitoringofthedynamicadhesionsofhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)onthemodifiedself-assembledfilmswithdifferentKRGDconcentrations(0μg·mL-1,25μg·mL-1,50μg·mL-1,75μg·mL-1,100μg·mL-1).Resultsindicatedthat,QCMgavethelargestresponsesignalsincludingfrequencychangeΔf,motionalresistancechangeΔR,andcellviscoelasticindexCVI(ΔR/Δf)whenKRGDconcentrationwas50μg·mL-1.SoitwasindicatedtheadhesionofHUVEConQCMsurfacewasthestrongest,andthemostorganizedcytoskeletalstructurewasthehardest.InthepresenceofmyosinⅡinhibitorblebbistatin，ΔfandΔRsignalsofQCMadheredHUVECreducedlargely,cells′adhesionbecameweaker,andcellsbecamesofter.TheresultsdemonstratedthatQCMcouldbeusedtomonitortheadhesionofHUVEConthemodifiedsurfaceswithdifferentKRGDconcentrationsandcell-druginteraction,soastoprovidedynamicinformationaboutcelladhesionstrengthandcellviscoelasticity.

humanumbilicalveinendothelialcell(HUVEC);celladhesion;cellviscoelasticity;quartzcrystalmicrobalance(QCM);KRGD;blebbistatin

国家自然科学基金面上项目(21275048)，湖南省科技厅重点项目(2013TT1009)

2017-01-04

熊伦(1991-)，女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：细胞与分子生物物理学，E-mail：15211082804@163.com；通讯作者：周铁安，教授，tieanzhou@hunau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.008

O647.1

A

1672-5425(2017)06-0036-05

熊伦，周铁安，黄复深，等.QCM实时监测人脐静脉内皮细胞在不同KRGD浓度自组装膜上的动态粘附[J].化学与生物工程，2017，34(6)：36-40.