乳腺癌新辅助化疗前后p62和XIAP表达的变化及其意义

韩 颖，吴正升，吴 强

乳腺癌新辅助化疗前后p62和XIAP表达的变化及其意义

韩 颖，吴正升，吴 强

目的 探讨乳腺癌新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NCT)前后自噬的变化及其与XIAP变化的关系。方法 应用免疫组化EnVision两步法检测NCT前后94对乳腺癌组织中p62和XIAP的表达，观察NCT后p62和XIAP表达的变化情况，分析其相关性。结果 NCT前乳腺癌标本中，p62高表达率为51.1%(48/94)，XIAP高表达率为84.0%(79/94)；NCT后乳腺癌标本中，p62高表达率升高为81.9%(77/94)，XIAP高表达率降低为35.1%(33/94)。即NCT后p62高表达率明显升高，XIAP高表达率明显降低(P均<0.05)。NCT前后相比，p62表达升高的样本率为73.4%，XIAP表达下降的样本率为75.5%，且p62表达变化与XIAP表达变化呈显著负相关(P<0.01)。结论 乳腺癌NCT后自噬增强与XIAP下调共存，且XIAP可能参与NCT后自噬增强的负性调节。

乳腺肿瘤；新辅助化疗；自噬；凋亡；p62；XIAP

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率逐年上升，已严重威胁我国妇女身心健康。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NCT)是目前治疗局部晚期乳腺癌的标准方案之一，能使局部晚期乳腺癌降期，提高手术切除率和保乳率，并且利于了解肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1]。研究表明抗癌疗法(如化疗、放疗、内分泌治疗)可诱导肿瘤细胞自噬，并且其是肿瘤细胞产生抗药性的机制之一[2-3]。自噬是依赖溶酶体途径对细胞内受损的细胞器和大分子物质进行降解的过程，p62是自噬的标志性蛋白，其表达量可用于监测自噬。XIAP是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中最受关注的成员，在肿瘤的进展、复发、预后以及肿瘤的化疗耐药中发挥重要作用[4-5]。目前，关于乳腺癌NCT后p62和XIAP表达的变化及其是否存在一定相关性尚未见报道。本文采用免疫组化EnVision两步法检测NCT前后p62和XIAP表达的变化，分析其相关性，探讨其可能的分子机制及生物学意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2010～2014年安徽医科大学第一附属医院病理科存档的94对乳腺癌石蜡标本，所有患者术前均经空心针穿刺证实为乳腺浸润性癌，并进行2～6个周期的NCT后行乳腺改良根治。依据WHO(2012)乳腺肿瘤标准对所有病例进行病理学分型、分级和分期。

1.2 试剂 兔抗人多克隆抗体p62和单克隆抗体XIAP购自Cell Signaling公司，稀释度分别为1 ∶500和1 ∶100，通用型EnVision两步法免疫组化试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法 组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色和免疫组化EnVision两步法染色。65 ℃烤片2 h，脱蜡、水化，高压修复100 s，自然冷却后滴加3%H2O2室温10 min，滴加一抗4 ℃过夜，复温加二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，观察。以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断 参考近期国外文献方法，每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，染色结果判定标准综合染色强度及阳性细胞率进行。(1)染色强度：无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分；(2)阳性细胞率：≤10%为0分,11%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。两者相加判断表达强度：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，6～7分为强阳性()。其中阴性和弱阳性为低表达，中度阳性和强阳性为高表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。样本率之间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验。

2 结果

2.1 NCT后乳腺癌组织形态学改变观察 NCT后较NCT前乳腺癌组织发生不同程度的退行性变化：(1)肿瘤实质主要表现为浸润性癌成分变性、坏死，导致仅残留原位癌结构或者纤维间质内仅见少数癌细胞呈条索状、巢团状排列，甚至仅残存单个癌细胞；乳腺癌细胞发生类似凋亡的形态学变化，主要表现为细胞皱缩，胞质嗜酸性增强，胞核固缩、染色增强，有时可见奇异型巨核。(2)肿瘤间质变化表现为间质纤维化、水肿、钙化、含铁血黄素沉着等。

2.2 NCT前后p62和XIAP在乳腺癌组织中的表达及其变化 (1)p62和XIAP在乳腺癌组织中的表达定位于细胞质和(或)细胞核。NCT前p62主要定位于细胞核且染色较弱，NCT后p62定位于细胞质和细胞核且染色较强；NCT前XIAP定位于细胞质和细胞核且染色较强，NCT后XIAP主要定位于细胞核且染色较弱(图1、2)。(2)94例NCT前乳腺癌穿刺标本中，p62高表达率为51.1%(48/94)，XIAP高表达率为84.0%(79/94)；94例NCT后乳腺癌手术标本中，p62高表达率升高为81.9%(77/94)，XIAP高表达率降低为35.1%(33/94)。即NCT后p62高表达率明显升高，XIAP高表达率明显降低，差异有统计学意义(P均=0.000，表1)。

2.3 NCT后p62和XIAP表达变化的相关性 94对NCT前后乳腺癌标本中，p62表达升高的样本率为73.4%(69/94)；XIAP表达下降的样本率为75.5%(71/94)。提示NCT后p62表达变化与XIAP表达变化呈显著负相关(rs=-0.302，P=0.003，表2)。

①A①B②A②B

图1 乳腺癌组织中p62的表达变化(同一病例)：A.NCT前p62呈低表达；B.NCT后p62呈高表达，EnVision两步法

图2 乳腺癌组织中XIAP的表达变化(同一病例)：A.NCT前XIAP呈高表达；B.NCT后XIAP呈低表达，EnVision两步法

3 讨论

自噬是真核细胞中高度保守又广泛存在的一种“自我消化”过程，当机体处于饥饿、营养不良等生理情况或暴露于低氧、辐射、细胞毒等压力环境时，自噬被激活，自噬小体形成，并通过与溶酶体融合成自噬溶酶体降解细胞内受损的细胞器和大分子物质，以实现细胞的再循环、再利用，维持内环境稳定[6-7]。自噬作为细胞的一种适应环境的保护机制，不仅参与细胞成分更新、细胞生长与分化等生理过程，更是参与包括肿瘤发生、发展、治疗耐药等多种病理过程。在肿瘤发生阶段，自噬抑制肿瘤形成，发挥抑癌作用；而在肿瘤进展和肿瘤治疗过程中，自噬激活则促进肿瘤细胞存活，发挥促癌作用[8]。在放、化疗等肿瘤治疗过程中，自噬被激活，进而通过溶酶体途径清除细胞毒性物质、受损的细胞器、循环再利用营养物质，阻止肿瘤细胞凋亡，发挥保护肿瘤细胞的作用[9]。

表1 NCT前后p62和XIAP蛋白表达的变化

表2 NCT后p62和XIAP表达变化的相关性

p62是SQSTM1编码的具有多个功能性结构域的泛素化蛋白，定位于细胞核，在细胞质中合成。p62通过其UBA区募集泛素化蛋白，借助其PB1区形成大的蛋白聚集体，进而造成p62构象改变，LIR区暴露，最后通过暴露的LIR区与定位于自噬小体膜上的LC3Ⅱ蛋白结合，在自噬溶酶体内降解[10]。p62和LC3Ⅱ是自噬的标志性蛋白，通过免疫组化技术检测经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋组织中p62和LC3Ⅱ的表达可以特异地、稳定地检测细胞内自噬活性[11-12]。p62结构域中还包含有2个NLS(核定位信号)和1个NES(出核信号)结构域[13]，可以通过与多种入核和出核信号分子结合，而在核质间自由穿梭。本组结果显示NCT前p62主要定位于细胞核，而NTC后定位于细胞核和细胞质，我们推测化疗药物可能通过激活某种出核信号分子与p62蛋白的NES结构域结合，介导p62蛋白穿梭到胞质中发挥自噬相关作用。

XIAP是IAP家族中的一员，可直接抑制凋亡起始因子Caspase 9以及效应分子Caspase 3与Caspase 7的活性，抑制外源性凋亡信号诱导的细胞凋亡，XIAP在大多数肿瘤组织中高表达并与化疗耐药有关。越来越多的证据表明，在细胞毒性药物介导的细胞凋亡中，自噬增强与XIAP下调共存[14-15]。本组结果与文献[14-15]报道一致，NCT后p62高表达率明显升高，XIAP高表达率明显降低；p62表达升高的样本率为73.4%，XIAP表达下降的样本率为75.5%，提示乳腺癌NCT后自噬增强与XIAP下调共存。

本课题组前期实验表明，XIAP能够抑制细胞自噬。本实验发现，XIAP通过结合并泛素化降解p62，抑制本底水平的自噬，促进肿瘤的生成；另一方面，XIAP下调造成p62介导的自噬增强对于肿瘤的转移至关重要[16]。Wu等[17]发现XIAP和LC3在肝细胞性肝癌组织中的表达呈负相关，并且低表达XIAP与高表达LC3的肝癌患者预后差，猜测肝癌组织中XIAP下调介导的自噬增强可能是预后差的分子机制。

本实验不仅证明乳腺癌NCT后自噬增强与XIAP下调共存，通过Spearman等级相关检验还发现，NCT后p62表达变化与XIAP表达变化呈明显负相关，并且NCT前后XIAP表达的定位变化与p62表达的定位变化正好相反，表现为NCT前XIAP定位于细胞质及细胞核而NCT后主要定位于细胞核。结合课题组前期关于XIAP泛素化降解p62的分析，推测NCT后XIAP主要定位于细胞核且表达下调，进一步导致细胞质中XIAP对p62蛋白的泛素化降解作用减弱，最终导致胞质中p62蛋白介导的自噬增强，即NCT后p62介导的自噬增强可能由XIAP下调导致，XIAP可能参与NCT后自噬增强的负性调节，为乳腺癌临床治疗提供新靶点和新思路，且本实验是在NCT患者活体乳腺肿瘤组织中获得自噬模型，为乳腺癌患者制定个体化治疗方案提供重要的临床信息。然而，乳腺癌NCT后自噬增强的调节机制以及XIAP如何调节细胞自噬还有待进一步分析。

综上所述，乳腺癌NCT后自噬增强与XIAP下调共存，且XIAP可能参与NCT后自噬增强的负性调节，为进一步分析自噬活性调节机制提供重要的参考价值。

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Changes of p62 and XIAP expression after neoadjuvantchemotherapy in breast cancer and their significance

HAN Ying, WU Zheng-sheng, WU Qiang

(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To explore the change of autophagy after neoadjuvant chemotherapy (NCT) and its relationship with XIAP expression in breast cancer tissues. Method The expression of p62 and XIAP was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step in 94 cases of breast carcinoma before and after NCT. The changes of p62 and XIAP expression after NCT were observed and their correlation was also analyzed. Results High expression rate of p62 and XIAP was 51.1% (48/94) and 84.0% (79/94) respectively in breast cancer tissues before NCT. The high expression rate of p62 was increased to 81.9% (77/94) and that of XIAP was reduced to 35.1% (33/94) in breast cancer tissues after NCT. The high expression rate of p62 was significantly increased while that of XIAP was significantly decreased after NCT (Pboth<0.05). The sample rate of increased expression of p62 and decreased expression of XIAP was 73.4% and 75.5% after NCT respectively. Furthermore, the change of p62 expression was significantly negatively correlated with the change of XIAP (P<0.01). Conclusion Suppression of XIAP and increased autophagic activity coexist in breast cancer after NCT, and XIAP may be involved in the negative regulation of enhanced autophagy.

breast neoplasm； neoadjuvant chemotherapy； autophagy； apoptosis； p62； XIAP

国家自然科学基金(81372476、81472493)

安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032

韩 颖，女，硕士研究生。E-mail: 1039400311@qq.com 吴 强，男，博士生导师，通讯作者。E-mail: aydjohn@yahoo.com

时间：2017-5-17 23:52 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.003.html

R 737.9；R 730.53

A

1001-7399(2017)05-0481-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.003

接受日期：2017-03-10