S100A4在类风湿关节炎滑膜中的表达及其对成纤维样滑膜细胞分泌VEGF促进血管生成的影响*

查丁胜， 吴 昊， 林宏生， 姚 平， 查振刚， 贾春宏， 盛 超

(暨南大学 1附属第一医院骨科， 2基础医学院生理教研室， 广东 广州 510630； 南方医科大学 3基础医学院细胞生物学教研室， 4南方医院妇产科， 广东 广州 51015)

S100A4在类风湿关节炎滑膜中的表达及其对成纤维样滑膜细胞分泌VEGF促进血管生成的影响*

查丁胜1△， 吴 昊1， 林宏生1， 姚 平2， 查振刚1， 贾春宏3， 盛 超4

(暨南大学1附属第一医院骨科，2基础医学院生理教研室， 广东 广州 510630； 南方医科大学3基础医学院细胞生物学教研室，4南方医院妇产科， 广东 广州 51015)

目的： 研究S100钙结合蛋白A4(S100A4)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者和正常人膝关节滑膜中的表达水平，以及S100A4对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes, RAFLSs)促进血管生成的影响。方法: 滑膜分别取自RA患者(RA组)及正常人(control组)膝关节，免疫组化法观察S100A4和VEGF蛋白在2组滑膜中的表达情况。RAFLSs分离自活动性RA滑膜；ELISA法检测S100A4刺激RAFLSs分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用；用rhS100A4孵育RAFLSs的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，检测S100A4体外血管生成能力。结果: S100A4及VEGF蛋白在RA组滑膜中高表达(P<0.05)，rhS100A4显著刺激RAFLSs分泌VEGF，呈时间和剂量依赖性(P<0.05)；rhS100A4孵育RAFLSs的条件培养基可促进HUVECs在体外形成管腔。结论: S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜中高表达，S100A4可通过促进RAFLSs分泌VEGF来刺激滑膜血管生成。这些结果提示S100A4可作为治疗RA的潜在靶点。

类风湿关节炎； S100钙结合蛋白A4； 成纤维样滑膜细胞； 血管生成

血管翳是引起类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)关节病变、软骨破坏的主要原因及病理基础。血管翳出现在绝大多数RA 患者病变关节腔内，主要由新生微血管、增生的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)、炎性细胞及机化的纤维素构成。新生血管形成被认为是形成和维持RA 血管翳的一个重要因素，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是新生血管形成的关键调控因素[1]。RA患者体液和关节液中都可检测到VEGF表达增加，血清中VEGF水平与RA炎症标志物的表达及疾病的严重程度密切相关[2-4]。在胶原诱导的RA动物模型中，在建模前，甚至在建模后注射抗VEGF 受体1抗体都能明显减轻关节炎症状[5-6]。已有研究表明在滑膜腔中，FLSs能表达VEGF蛋白[7]，但VEGF表达受何者调控、以及何种因素活化FLSs促进VEGF表达，目前仍未被完全阐明。

S100钙结合蛋白A4(S100 calcium-binding protein，S100A4)是S100蛋白家族成员之一。S100蛋白是一个酸性的Ca2+结合蛋白家族，主要存在于脊椎动物中，具有EF手型结构，具备细胞内和细胞外调节活性。S100A4调控细胞运动、侵袭、增生，与细胞分化、凋亡和基质降解有关[8]。在肿瘤方面的研究发现，S100A4能通过促进血管新生进而促进肿瘤的形成[9]，与肿瘤的发生、转移及预后密切相关。抗S100A4单克隆抗体能抑制血管形成，进而抑制肿瘤生长[10]。目前有研究表明，RA患者血清S100A4水平与病情发展呈正相关[11]。基于上述研究，我们推测在RA患者病情发展中S100A4可能促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes, RAFLSs)分泌VEGF，从而影响RA病程的发生发展。

为进一步探讨S100A4在RA发病过程中的作用，我们观察RA患者及健康人膝关节滑膜组织中S100A4蛋白的表达情况；分离活动性RA患者膝关节滑膜组织体外行RAFLSs培养，观察rhS100A4对RAFLSs分泌VEGF的作用，用rhS100A4刺激RAFLSs所形成的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，检测S100A4体外成血管能力。

材 料 和 方 法

1 标本来源

选取2014年1月～2015年12月在暨南大学第一附属医院骨科住院治疗的患者14例，其中行膝关节置换术的RA患者7例，膝关节外伤行滑膜切除术的正常人7例。RA患者均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA分类标准，并除外其它自身免疫性疾病、感染、肿瘤等关节相关疾病。所有病例均经暨南大学附属第一医院伦理委员会审查通过，并签署知情同意书。

2 细胞及试剂

HUVECs(广州奕源生物)；免疫组化试剂盒(武汉博士德)；鼠抗人波形蛋白单抗(Santa Cruz)；rhS100A4 (R&D)；人VEGF ELISA试剂盒(R&D)；Growth Factor-Reduced (GFR) Matrigel (BD)；抗VEGF抗体(Sigma)。

3 主要方法

3.1 免疫组化法检测S100A4及VEGF蛋白在RA患者膝关节滑膜组织中的表达情况 研究对像行膝关节手术时，在术中取少量关节滑膜组织大小约1.5 cm×1.5 cm × 0.3 cm，术后立即用4%甲醛固定。通过石蜡切片及免疫组化染色，将S100A4及VEGF蛋白染色以细胞质呈棕黄或棕褐色定为阳性。免疫组化阴性对照染色处理方法：免疫前血清代替I抗，细胞质呈蓝色为阴性。RA患者为RA组、正常人为对照组(control组)，光镜下观察S100A4和VEGF蛋白在RA组和control组滑膜组织中的表达情况。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫组化结果：将免疫组化图片导入软件中，每张照片在滑膜染色区釆集10个区域，计算积分吸光度(integral absorbance,IA)；然后采用软件计算区域内所有细胞的面积，计算平均吸光度(mean absorbance，MA)，每组所有照片的平均值代表该组的MA值。

3.2 RAFLSs原代培养及鉴定 术中无菌条件下取RA患者膝关节滑膜组织大小约1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，在灭菌超净工作台内将滑膜剪成约1 mm3的组织块，采用组织块原代培养方法进行FLSs培养。采用生长状态良好的第3～5代细胞进行实验。免疫组化法对FLSs波形蛋白(vimentin)进行鉴定，根据试剂盒说明书进行SABC-DAB 法染色。

3.3 ELISA法检测rhS100A4对RAFLSs分泌VEGF水平的影响 将RAFLSs与500 μg/L rhS100A4分别孵育不同时间(0、24、48、72和96 h)，RAFLSs分别与不同浓度(0、10、100、500和1 000 μg/L)的rhS100A4共同孵育48 h。按照ELISA 试剂盒说明检测 RAFLSs细胞培养上清液中 VEGF的浓度。

3.4 rhS100A4孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外形成血管的作用 实验的前一天，将GFR Matrigel放于4 ℃融化，灭菌的100 μL枪头，48孔板冷藏备用。开始实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和孔板，在48孔板中每孔加入200 μL GFR Matrigel，37 ℃包被2 h，取2×104个HUVECs细胞重悬于200 μL条件培养基后，加入到已经包被的48孔板中。根据干预的条件培养基不同，分为以下4组：control组(DMEM培养液孵育RAFLSs 48 h后收集的条件培养基)；S100A4组(500 μg/L rhS100A4的DMEM培养液孵育RAFLSs 48 h后收集的条件培养基)；S100A4+anti-VEGF组(含500 μg/L rhS100A4+10 μg/L anti-VEGF 单克隆抗体的DMEM培养液孵育RAFLSs 48 h后收集的条件培养基)；anti-VEGF组(含10 μg/L anti-VEGF 单克隆抗体的DMEM培养液孵育RAFLSs 48 h后收集的条件培养基)。每个处理重复3孔，然后在37℃、5% CO2下培养9 h，在倒置显微镜下拍照，运用 Image-Pro Plus 软件计算总的血管腔形成个数，并进行数据分析。

4 统计学分析

采用 SPSS 13.0统计软件，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 S100A4及VEGF蛋白在RA患者膝关节滑膜中的表达情况

利用免疫组化法分别检测到S100A4蛋白及VEGF蛋白在RA患者膝关节滑膜组织细胞的胞浆和胞外液中均有高表达(细胞核被染上了蓝色，胞浆间及胞外液间均呈黄色(强阳性的区域呈现棕黄色)。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析滑膜免疫组化染色区平均吸光度，与control组相比，差异均有统计学显著性(P<0.01)，见图1、2。

2 RAFLSs原代培养及鉴定

原代培养5～7 d即可见到组织块周围有细胞游出。滑膜细胞在体外培养条件下通过2～3次传代后主要以梭形的FLSs为主。光镜下FLSs呈长梭形，两极胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。细胞核呈卵圆形位于细胞中央，胞浆透亮，排列有局部方向性。采用中胚层组织细胞特征性蛋白vimentin单克隆抗体进行免疫组化标记，FLSs胞浆呈现棕黄色，见图3。

Figure 1.Expression of S100A4 protein in synovial tissue of human knee joint (immunohistochemical staining, ×100). Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

图1 S100A4蛋白在人膝关节滑膜组织中的的表达

Figure 2.Expression of VEGF protein in synovial tissue of human knee joint (immunohistochemical staining, ×100). Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

图2 VEGF蛋白在人膝关节滑膜组织中的的表达

Figure 3.Primary culture and identification of RAFLSs(×100). A: RAFLSs under light microscope (synovial tissue culture); B: vimentin protein staining of RAFLSs (immunohistochemical staining).

图3 RAFLSs原代培养及鉴定

3 rhS100A4对RAFLSs 分泌VEGF的影响

通过ELISA法检测发现，RAFLSs与500 μg/L rhS100A4共同孵育不同时间及与不同浓度的rhS100A4共同孵育48 h后VEGF蛋白的分泌均明显增加，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

Figure 4.Time-dependent effect (A) and dose-dependent effect (B) of rhS100A4 on the secretion of VEGF by RA-FLSs. Mean±SD.n=6．**P<0.01vs0 h;##P<0.01vs0 μg/L.

图4 rhS100A4刺激RAFLSs分泌VEGF的时间、剂量-效应关系

4 rhS100A4孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外形成血管的作用

通过建立Matrigel基质胶HUVECs体外形成血管模型发现，rhS100A4组明显促进HUVECs体外形成血管，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；rhS100A4的体外成血管作用可被VEGF的中和抗体有效抑制，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图5。

Figure 5.Effects of RAFLS-conditioned medium with rhS100A4 on angiogenesis of HUVECs. Mean±SD.n=3．##P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsrhS100A4.

图5 S100A4孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外形成血管的作用

讨 论

RA主要表现为关节滑膜的慢性炎症、滑膜血管翳形成，关节软骨破坏，最终导致关节畸形、功能丧失。滑膜血管翳形成是 RA 最基本、最重要的病理表现。近年来，人们已经认识到滑膜血管翳形成不仅在 RA 的侵蚀和破坏过程中发挥了重要作用[12]，而且它在RA病程的早期便开始作用并贯穿于整个病程。

在 RA中，促进血管形成最重要的细胞因子是VEGF。VEGF不仅促进了RA滑膜血管翳形成，而且也是RA发病过程中的直接促炎因子。影响VEGF 表达的因素很多，目前调节VEGF表达的机制尚未完全阐明[13]。作为血管生成过程中最重要的因子，如何阻断VEGF功能的实现将成为治疗RA的一种新方法，与已有的各种方法相结合，为RA患者病情的临床控制做出贡献。

S100A4属于钙离子结合蛋白S100蛋白家族，该家族成员均可参与细胞骨架及胞膜的相互作用以及钙离子信号传递和细胞的分化等。S100A4最具特征的功能是它既可在胞内、又可在胞外发挥作用[14]，它在肿瘤中的作用主要表现为促进肿瘤进展，导致肿瘤细胞的侵袭和活动能力增强[15]。Ambartsumian等[16]的研究表明，S100A4有很强的促血管生成作用，对血管生成有直接的促进作用，几乎参与了肿瘤发生、发展及转移的整个病理生理过程。

研究显示，RAFLSs具有转化细胞特征，在连续培养中这些成纤维细胞表现出高增殖率、接触抑制缺失、组成性表达细胞因子mRNA和锚定非依赖性细胞生长等一些新的特性，这种转化特性在RA的发生、发展中发挥着T细胞依赖途径所不可解释的重要作用[17]。RAFLSs的生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性。S100A4蛋白为S100蛋白家族成员之一，其与肿瘤生物学特性的相关性已毋庸置疑，由于RAFLSs的生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性，S100A4与RA的关系越来越受到研究人员的关注。

在我们的实验中通过免疫组化技术发现RA患者膝关节滑膜中S100A4蛋白较对照组正常人膝关节滑膜中表达明显升高，提示S100A4蛋白高表达可能与RA患者关节炎发展呈正相关。有文献报道，在RA增殖的FLSs中发现S100A4 mRNA表达增高，细胞外S100A4可调节基质金属蛋白酶(MMP)的产生，甚至RA患者血浆中S100A4水平增高[18]。另外，RA患者膝关节滑膜组织中VEGF蛋白同时表达增加，S100A4是否可促进RAFLSs分泌表达VEGF呢？

为明确S100A4是否有促进RAFLSs分泌VEGF的作用，我们采用组织块原代培养方法进行RAFLSs培养，采用生长状态良好的第3代细胞进行试验，ELISA法观察到rhS100A4能刺激RAFLSs分泌VEGF，且效果成浓度和时间依赖性。通过Matrigel基质胶成血管实验，rhS100A4孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外管腔形成的作用发现，与空白对照组相比，rhS100A4孵育组基质胶内形成的管腔数量明显较空白组多，VEGF抗体可明显抑制rhS100A4孵育组的管腔形成作用。我们的实验表明，rhS100A4体外可促进RAFLSs分泌VEGF，且rhS100A4孵育RAFLSs培养基可促进体外基质胶内HUVECs形成大量管腔，该作用可被抗体VEGF所阻断，提示体外rhS100A4可通过刺激RAFLSs分泌VEGF并间接促进HUVECs形成管腔。

促血管内皮细胞增殖和增加血管通透性是VEGF最主要的生物学功能。RA患者血清和滑液中的VEGF浓度均明显高于骨关节炎和对照组，血清VEGF浓度与血沉、血清C反应蛋白浓度、血清类风湿因子、关节肿痛度明显相关[19]，这提示血清和滑液中 VEGF 水平可作为判断 RA 早期病变活动的一个指标。

正常机体内，新生血管的生成受到严格的控制，而在RA中这种血管新生却是病理性无限制的。病理性无限制的血管生成是 RA 慢性滑膜炎和血管翳生成过程中重要驱动因素，RA关节滑液和滑膜中富含 VEGF，有助于 RA 关节炎中血管的渗透和血管新生，影响 VEGF 表达的因素很多，而且调节机制复杂，许多问题至今未明[13]。我们的实验发现S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜组织内高表达，体外rhS100A4可促进RAFLSs分泌VEGF并间接促进HUVECs形成管腔。

S100A4调控细胞运动、侵袭、增生，与细胞分化、凋亡和基质降解有关[12]。有研究发现S100A4在RA患者滑膜组织细胞及软骨和骨组织破坏处均有表达[20-21]，Oslejsková等[22]发现血液中S100A4升高的水平与RA患者关节炎的病变严重程度呈正相关。此外，还有研究表明在体外培养的原代RAFLSs中，S100A4能活化RAFLSs，调控基质金属蛋白酶1、3、9、13的生成[23]。在肿瘤方面的研究发现，S100A4能通过促进血管新生进而促进肿瘤的形成[24]，与肿瘤的发生、转移及预后密切相关，抗S100A4单克隆抗体能抑制血管形成，进而抑制肿瘤生长[10]。柏干苹等[25]建立大鼠佐剂性关节炎模型，在干扰组大鼠关节腔内注射S100A4 siRNA片段，抑制S100A4基因表达，能显著降低致炎细胞因子TNF-α、IL-1β及促血管生成因子VEGF的表达，减轻关节滑膜的病理损伤。国内外其他学者的研究表明，S100A4参与了RA病程的发展和病理过程。我们的研究表明S100A4参与了RA的病理过程，可促进滑膜血管翳形成关键因子VEGF的表达。

目前，国内外相关研究的报道主要从临床水平观察指标、RA患者关节滑膜标本及RA动物模型滑膜标本及体外细胞实验来分析探讨S100A4参与了RA的病理过程，还缺乏系统性的临床对照试验研究来分析S100A4在RA患者病情发展过程中的作用。我们的研究亦缺乏血清S100A4水平或滑膜、关节软骨内S100A4蛋白水平与RA患者病情轻重、关节软骨破坏程度的相关数据，体外研究尚缺乏动物模型数据来进一步验证、观察细胞模型数据的结果。本课题拟将进一步从临床水平、RA动物模型来观察验证S100A4在促进RA滑膜组织血管形成中的作用。

综上所述，滑膜血管形成是RA的重要病理过程，促血管内皮细胞增殖和增加血管通透性是VEGF最主要的生物学功能。我们的研究表明S100A4蛋白在RA患者滑膜组织表达增加，体外可促进RAFLSs分泌VEGF并间接促进HUVECs形成管腔。S100A4可能是RA患者滑膜组织炎症反复发作的一种新的致病因素，S100A4也为进一步研究RA发病机制及新的治疗靶点提供线索。

致谢：感谢骨关节外科刘宁主任、李劼若博士、郇松玮博士、佘国荣博士、候辉歌博士、张怀添博士在取膝关节滑膜组织中给予的帮助。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Expression of S100A4 in synovium of patients with rheumatoid arthritis and its effect on angiogenesis of fibroblast-like synoviocytes by secreting VEGF

ZHA Ding-sheng1, WU Hao1, LIN Hong-sheng1, YAO Ping2, ZHA Zhen-gang1, JIA Chun-hong3, SHENG Chao4

(1DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;3DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalSciences，4DepartmentofObstetricsandGynecology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:zdsuser@126.com)

AIM: To study the expression level of S100 calcium-binding protein A4 (S100A4) in synovial tissue of the knee joint in rheumatoid arthritis (RA) patients and normal persons, and the effect of S100A4 on the angiogenesis induced by rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RAFLSs). METHODS: The synovial tissue was taken from the knee joint of the RA patients (RA group) and the normal persons (control group). The protein expression of S100A4 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the synovial tissue of the 2 groups was observed by immunohistochemistry. RAFLSs were isolated from synovial tissue of patients with active RA. ELISA was used to detect the effect of S100A4 on the secretion of VEGF by RAFLSs. The effect of S100A4 on the angiogenesis of HUVECs cultured with conditioned medium from RAFLSs was also detected. RESULTS: The protein of S100A4 and VEGF was highly expressed in the synovial tissues of RA group (P<0.05). rhS100A4 significantly stimulated the secretion of VEGF in RAFLSs in a time- and dose-dependent manner (P<0.05). Cultured with conditioned medium from RAFLSs, rhS100A4 significantly promoted HUVECs to form tube-like structuresinvitro. CONCLUSION: S100A4 protein is highly expressed in synovial tissue of the knee joint in RA patients, and S100A4 stimulates synovial angiogenesis by promoting RAFLSs to generate VEGF, indicating that S100A4 may be used as a potential target for the treatment of RA.

Rheumatoid Arthritis; S100 calcium-binding protein A4; Fibroblast-like synoviocytes; Angiogenesis

1000- 4718(2017)06- 1119- 06

2017- 04- 20

2017- 05- 18

国家自然科学基金青年项目(No. 81401766)；广东省医学科研基金(No. B2012196)；暨南大学科研培育与创新基金青年基金(No. 21612303)；暨南大学附属第一医院培育基金(No. 2012-1)

R684.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.026

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-38688548; E-mail: zdsuser@126.com