人参黑斑病菌对人参根系分泌物中氨基酸的化学趋向性响应研究

张爱华+马文丽+雷锋杰+安宁波+张欣欣+刘志庆+张连学

[摘要] 该实验采用平板对峙培养法和孢子悬滴萌发法探讨了人参黑斑菌对精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸以及苏氨酸在不同条件下化学趋向性响应。结果显示，人参黑斑菌对4种氨基酸化学趋向性响应的最优培养温度均为25 ℃，不同质量浓度和pH的培养条件下人参黑斑菌对4种氨基酸化学趋向性响应有所差异，其中精氨酸、谷氨酸及苏氨酸在质量浓度为2 mg·L^-1，pH 7，天冬氨酸在20 mg·L^-1，pH 6时，化学趋向性均达到最强，其趋化率分别为1.24，1.38，1.27，1.31；生长速率分别为0.451 0，0.353 0，0.381 3，0.228 8；孢子萌发率分别为57.33%，63%，56.67%，58%；菌丝干重分别为372.9，348.5，314.4，390.2 mg·L^-1。氨基酸作为人参根系分泌物中的重要物质对人参黑斑病菌表现出了高效的趋化性效应，有的甚至出现了高浓度抑制的现象。

[关键词] 人参黑斑病菌；根系分泌物；氨基酸；化学趋向性

[Abstract] Plate assay and spore germination method were used to study the chemotaxis response of Alternaria panax to arginine，glutamic acid，aspartic acid and threonine. The result showed that the optimum temperature of A. panax chemotaxis response to four amino acids were all 25 ℃. And chemotaxis responses of A. panax were different under conditions of different concentration and pH value. The chemotaxin reached to the highest under the condition of 2 mg·L^-1 and pH value was 7 for arginine，glutamic acid and threonine while 20 mg·L^-1 and pH value was 6 for aspartic acid . The data of chemotactic migration index （CMI） were 1.24，1.38，1.27，1.31 and chemotactic growth rates（CGR） were 0.451 0，0.353 0，0.381 3，0.228 8 and spores germination rates（SGR） were 57.33%，63%，56.67%，58% and the dry weight of mycelial （DWM） were 372.9，348.5，314.4，390.2 mg·L^-1 respectively. It indicated that the low and middle concentration of amino acid had significant promoting effect on chemotaxis response of A. panax. As important substances generated in ginseng root，amino acids exhibited an efficient chemotactic effect on A. panax，and some even show inhibition effect under high concentration .

[Key words] Alternaria panax；root exudates；amino acid；chemotaxis

人參Panax ginseng C.A.Mey.为五加科草本植物，享有“百草之王”的美誉。长期以来，由于原始生态环境的改变以及不断的过度采挖致使我国野生人参资源匮乏。近年，我国人参栽培产业迅猛发展，人工栽培面积逐年扩大，栽培种类繁，但由于生长环境的改变以及人参病害的发生和流行导致人参产量大幅度下降，其中人参黑斑病菌是发生最普遍，危害最严重[1]，更是人参规范化生产的重要病害。根系分泌物是植物在生长的过程当中产生的并经根的不同部位向外界环境分泌的物质[2]，此类物质作为趋化基质在植物与真菌之间起着调节作用[3-4]，而这一趋化性运动是病原真菌对不同趋化物质浓度、温度、pH做出的反应，使趋向有益刺激，逃避有害刺激[5-6]，并且与植物的生长有很密切的关系。张爱华、匙坤等通过研究人参根系分泌物中的人参皂苷对人参几种病原菌的趋化作用，发现人参皂苷可作为趋化因子在人参和微生物种群之间起调控作用[7-9]。除此之外，据有关报道，其他很多种微生物对植物的根系分泌物也同样具有趋化作用[10]。近年来，氨基酸作为一类重要的趋化物质备受关注[11]。霍艺丹等报道了人参的16种氨基酸含量中精氨酸含量最高，其次为谷氨酸和天冬氨酸，蛋氨酸含量最低[12]。而前期实验室在水相及正丁醇相人参根系分泌物中均检测到了氨基酸成分，其中包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等15种氨基酸，这一成果为本实验提供理论依据。迄今为止，有关人参根系分泌物产生的氨基酸对人参病原真菌的研究还鲜有报道，本实验采用外源性氨基酸探索氨基酸对人参黑斑病菌的化学趋向性作用。这一实验研究旨在为以后防治人参黑斑病菌提供参考。

1 材料

人参黑斑病菌Alternaria panax Whetz.由吉林省人参工程技术研究中心提供，并经过吉林农业大学高洁教授鉴定确认。精氨酸（BR，纯度99%）、谷氨酸（BR，99%）、天冬氨酸（BR，99%）及苏氨酸（BR，99%）。孟加拉红培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

2 方法

2.1 培养基及氨基酸种类的选择

为了更清晰地观察到菌丝生长的情况所以选择孟加拉红培养基进行趋化性实验；而对于氨基酸的选择是依据文献确定此4种氨基酸在人参中的含量相对较高，且在人参根系分泌物中检测到这些氨基酸。以无菌水为对照组来进行实验。

2.2 菌液的制备

刮取适量人参黑斑病菌菌丝加入到装有10 mL无菌水的EP管中（在无菌操作环境中进行），在漩涡混合器将其混匀，用血球计数板计算孢子浓度，最终得到浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1的孢子懸浮液，待用。

2.3 不同氨基酸趋化液的制备

用灭菌后的蒸馏水分别配制精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及苏氨酸，使其分别的浓度依次为0.2，2，20，200 mg·L^-1的趋化液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，待用。

2.4 化学趋向性试验

根据匙坤等的方法[7]，在孟加拉红固体培养基上依次等距离打3个孔，分别记为 A，B，C，每孔的间距为20 mm，两孔之间用灭菌滤纸条连接，然后用移液枪吸取30 μL孢子悬浮液加到B孔中，吸取50 μL趋化液和无菌水分别加入到A，C孔中，每个处理5次，见图1。

2.4.1 人参黑斑病菌化学趋向性最适培养条件的选择

2.4.1.1 浓度对黑斑病菌化学趋向性的影响 将4种不同趋化物质分别按2.3项配制成一定浓度梯度的趋化液，进行化学趋向性实验，黑暗条件下培养 5 d。

2.4.1.2 温度对黑斑病菌化学趋向性的影响 将质量浓度为2 mg·L^-1的精氨酸，谷氨酸，苏氨酸及质量浓度为20 mg·L^-1趋化液分别置于15，20，25，30 ℃，黑暗条件下培养5 d。

2.4.1.3 pH对黑斑病菌化学趋向性的影响 将趋化液的pH分别配制成5，6，7，8，进行化学趋向性实验，将人参黑斑病菌置于 25 ℃ 、 黑暗条件下培养 5 d。

2.4.2 最优趋化参数条件下测定指标

2.4.2.1 病原菌丝趋化移动指数（chemotactic migration index，CMI） 移动距离标准为大多数菌丝移动的最前端为测定标准，菌丝从B向A移动的距离为a，向C移动的距离为b。计算公式CMI=a/b。当 a/b>1时，趋化物质对测定病原微生物有促进作用；当a/b<1时，则有抑制作用；当 a/b=1时，无趋化作用。

2.4.2.2 病原菌丝趋化生长速率 （chemotactic growth rate，CGR） 采用固体培养基法[13]，依次测定第2，3，4，5天共4 d的菌丝生长情况，计算公式CGR=（a-b）/d （d为培养天数）。

2.4.2.3 病原菌孢子萌发率 （spore germination rate，SGR） 参考李勇等[14]的孢子萌发悬滴法，在双凹载玻片的左右凹槽内分别滴加20 μL的趋化液和无菌水，载在2个凹槽内分别滴加等体积的适量菌液，使不同处理后的菌液终浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1，12 h后记录10倍目镜×40倍物镜视野下300个孢子的萌发情况，每个处理5次，并计算孢子的萌发率。

2.4.2.4 病原菌菌丝干重（dry weight of mycelial，DWM） 参照樊慕贞的菌丝干重法[15]测定6 d人参黑斑菌在不同趋化液的条件下菌丝生长情况。

2.4.3 数据分析

采用2010版Excel对实验数据进行处理，利用 SPSS 18.0中的单因素方差分析（One-Way ANOVA 结合LSD） 对统计结果进行显著性方差分析。

3 结果与分析

3.1 浓度不同的趋化液对人参黑斑菌的化学趋向性的影响

不同浓度的4种氨基酸分别对人参黑斑病菌表现出不同程度的化学趋向性。并且均随着浓度的增加出现增加而后降低的现象，见表1。其中，人参黑斑病菌对浓度为2 mg·L^-1的精氨酸、谷氨酸、苏氨酸及20 mg·L^-1的天冬氨酸表现出最强的化学趋向性（P<0.05），CMI分别为1.166 3，1.243 1，1.102 9，1.203 2。而对200 mg·L^-1的精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸均有不同程度的抑制作用。

3.2 温度对人参黑斑病菌化学趋向性的影响

由表1可以看出，人参黑斑病菌在不同温度条件下培养均表现出正趋化性，并且4种氨基酸都在25 ℃时候表现出高效的趋化性。精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苏氨酸的CMI分别是1.163 1，1.178 9，1.255 7，1.105 3。

3.3 pH对人参黑斑菌的化学趋向性的影响

通过对不同pH的比较显示，4种趋化液的不同pH均表现出了不同程度的促进作用，其中精氨酸，谷氨酸及苏氨酸在pH 7时，天冬氨酸在pH 6时有最大趋化性，CMI分别是1.163 7，1.236 2，1.075 1，1.178 9。

3.4 最优趋化参数下人参黑斑病菌对不同趋化液的化学趋化性响应

3.4.1 最优趋化移动指数

人参黑斑病菌在温度为25 ℃时对精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及苏氨酸均表现出了高效的正向趋化作用，且对4种氨基酸之间的趋化作用差异不大，CMI分别为1.24，1.38，1.31，1.27，见图2。

3.4.2 菌丝生长速率的测定

4种不同趋化液在最优参数下对人参黑斑病菌菌丝生长速率有很强的促进作用，并且在一定的培养时间范围内，菌丝的生长速率都随培养时间的增加而加快，见图3。到第5天时，有最大的测定值，CGR分别为0.534 6，0.465 0，0.436 0，0.517 3。

3.4.3 菌丝生长量的测定

4种不同趋化液在最优参数下对人参黑斑病菌菌丝生长量有所差异，并且均显著高于对照组，见图4。对照组的DWM为121.7 mg·L^-1，但在精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及苏氨酸的DWM分别为372.9，388.5，390.2，335.4 mg·L^-1。

3.4.4 孢子萌发率的测定

4种不同趋化液在最优参数下对人参黑斑病菌的孢子萌发率均高于对照组，其中对照组的SGR为19.33%，而实验组的SGR分别为57.33%，63%，58%，56.67%，见图5。由此说明，氨基酸能诱导人参黑斑病菌的病原孢子萌发，这能有效的促进人参黑斑菌的孢子生长。

3.4.5 初生菌丝生长状况

A到D为人参黑斑病菌在精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及苏氨酸的趋化影响下边缘菌丝显微鉴定图，见图6。与对照组比较，在趋化液的影响下病原菌菌丝生长密集、分枝多、菌丝体较长；然而很明显的观察到对照组的菌丝生长缓慢菌丝体相对较短，且无明显的延伸。

4 结论与讨论

目前研究药用植物化学趋向性作用的常用方法为生物技术，通过观察植物或土壤微生物对物质不同程度的反应，来确定物质的活性[16]。药用植物通过根分泌多种化合物可以调节在它附近的土壤微生物的群落，改变土壤的化学和物理性质[17]，这可能表现出根系启动效应直接影响碳和氮循环[18]。由于根系分泌物的组成范围广泛，因此越来越多的学者对这一领域进行进一步研究，钟荣顺等研究了组氨酸、精氨酸、苏氨酸等9种氨基酸作为氮源对大豆炭疽病菌菌丝的生长情况，得出部分如苏氨酸、丙氨酸、精氨酸等氨基酸对菌丝的生长有一定的促进作用[19]。

该文集中探讨人参黑斑病菌对根分泌物成分精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及苏氨酸的化学趋向性响应。通过实验得出，氨基酸作为化感因子对人参黑斑病菌起着调控作用，此类物质不仅对人参黑斑病菌的菌丝生长有促进作用，而且对病原菌在一定参数范围内有促进孢子萌发的作用。人参黑斑病菌对中低浓度的不同趋化液及高浓度的苏氨酸有着不同程度的促进作用，对高浓度的精氨酸、谷氨酸及天冬氨酸均表现出了明显的抑制作用，这一结果可能与不同氨基酸在人参根系分泌物中百分含量不同有关。而对高浓度的苏氨酸对4种氨基酸都在25 ℃时有较强的趋化效果，恰巧此温度在人参黑斑病菌菌丝生长的最适温度内，并且该菌对中性及偏酸性的氨基酸表现出更强的化学趋向性响应，这一特点与其自身生长的pH相吻合，因此，说明病原菌菌丝的化学趋向性与其自身的生物学特性有着密不可分的关系。

本实验对于人参黑斑病的发生流行机理揭示有一定的理论参考，对合理有效地调控根系生态环境具有指导意义。同时，对于该人参病害的防治能提供新的思路和方向，化学趋向性是病害发作的前提，在此阶段能够减少降低该病菌所需要的营养物质及改变其最适生长环境，将在以后的田间防治方面取得事半功倍的效果。另外，为生产中安全，高效防治人参病菌坚持预防为主、生物防治的原则，尽可能避免化学防治造成的负面影响。该实验只考察了病原菌对单一氨基酸的化学趋向性研究，然而对多种氨基酸的混合液是否有更强的趋化效果有待进一步研究。

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[责任编辑 吕冬梅]