橙皮素衍生物-XIV调控PTCH1基因甲基化对佐剂性关节炎大鼠FLS炎症的影响

孙正浩，刘彦会，刘骏达，徐丹丹，李小枫，张义龙，孟晓明，黄 成，李 俊

(1.安徽医科大学药学院，安徽省重大自身免疫性疾病重点实验室，安徽省创新药物产业共性技术研究院，2.抗炎免疫药物教育部重点实验室，3. 安徽医科大学肝病研究所，安徽 合肥 230032)

橙皮素衍生物-XIV调控PTCH1基因甲基化对佐剂性关节炎大鼠FLS炎症的影响

孙正浩1,2,3，刘彦会1,2,3，刘骏达1,2,3，徐丹丹1,2,3，李小枫1,2,3，张义龙1,2,3，孟晓明1,2,3，黄 成1,2,3，李 俊1,2,3

(1.安徽医科大学药学院，安徽省重大自身免疫性疾病重点实验室，安徽省创新药物产业共性技术研究院，2.抗炎免疫药物教育部重点实验室，3. 安徽医科大学肝病研究所，安徽 合肥 230032)

目的 研究5-(4-氯苯乙基)亚胺基-7-氧-乙酰-4-氯苯乙胺基橙皮素，即橙皮素衍生物XIV号(hesperidin derivative-XIV，HDND-XIV)对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)炎症的影响及分子机制。方法 弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant，FCA)诱导Sprague Dawley(SD)大鼠AA模型(FCA，0.01 ml·kg-1)，造模后24 d处理并提取原代FLS；MTT法检测HDND-XIV的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50); 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定细胞培养基中FLS分泌的白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)水平; Lipofectamine2000转染试剂盒将过表达质粒GV230-MeCP2转染入AA FLS;Western blot法检测MeCP2、PTCH1、Gli1、Shh蛋白的表达;焦磷酸测序法定量检测各组PTCH1基因的甲基化程度。结果 MTT法检测HDND-XIV在FLS上的IC50值为161 μmol·L-1；ELISA筛选出HDND-XIV最佳抗炎浓度为10 μmol·L-1;Western blot结果显示经HDND-XIV刺激后，AA FLS中PTCH1表达升高，MeCP2、Gli1和Shh表达下降; 焦磷酸测序显示经HDND-XIV刺激后，AA FLS中PTCH1基因甲基化程度明显降低；在AA FLS中过表达MeCP2后加HDND-14刺激, Western blot结果显示成功过表达MeCP2后,PTCH1蛋白表达下降, 而Gli1和Shh蛋白表达升高, ELISA结果显示IL-6、IL-1β、TNF-α水平也升高。结论 HDND-XIV对于FLS有较明显的抗炎活性, 其机制可能与抑制MeCP2的表达，降低PTCH1基因甲基化程度有关。

HDND-XIV；SD大鼠；佐剂性关节炎；甲基化；Hedgehog；成纤维滑膜细胞；过表达；炎症

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫炎症疾病，其主要特征是关节肿胀与不可逆性的损坏，慢性的滑膜炎症[1]。成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA发病中显示出独特的特性，参与血管新生，免疫应答，关节损伤等过程，并产生炎性细胞因子促进炎症的发生[2]，慢性炎症导致多种炎症因子异常并使关节损伤[3]。文献报道，特定基因的甲基化参与RA的发病[4]，甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MeCP2)是MBD家族的成员，可以特异性的识别和绑定在甲基化的DNA序列上，从而抑制基因的转录，也可招募甲基化酶，组蛋白去乙酰化酶甲基化DNA[5]。

Hedgehog信号通路对组织的形态和生长给予调控，Patch1(PTCH1)在此通路中是一个负调控基因[6]。目前研究表明[7-8]，在胃癌、肝细胞癌等癌症中，癌细胞异常增殖，PTCH1基因发生高甲基化。RA中FLS呈肿瘤细胞样增殖[9]，鉴于癌症与RA在细胞增殖方面的共性，靶向调控PTCH1基因的甲基化，可能成为治疗RA的新疗法。橙皮素是二氢黄酮的一种，有着抗氧化和抑制炎症介质产生的药理作用[10]。为了克服半衰期短，口服给药后失效快的问题，本课题组设计合成了橙皮素衍生物XIV号(hesperidin derivative-XIV，HDND-XIV)，并进行抗炎筛选，其化学式为C34H32Cl2N2O6，分子质量为635.5380，结构如Fig 1。

因佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型具有与RA相似的病理学特征和免疫学变化，所以广泛用于研究RA的发病和筛选新药治疗风湿性疾病[11]，本实验即采用AA大鼠为动物模型，重点研究HDND-XIV对PTCH1基因甲基化的调控。基于FLS在RA发病中的重要作用，以FLS为研究对象，通过观察HDND-XIV对AA FLS分泌白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的影响和对AA FLS表达MeCP2，PTCH1和Hedgehog信号通路相关蛋白Gli1和Shh的影响，以及HDND-XIV对PTCH1基因甲基化的调控，研究HDND-XIV抑制FLS炎症可能存在的机制，为防治RA提供理论依据。

Fig 1 Chemical formula

1 材料

1.1 实验动物 清洁级♂Sprague Dawley(SD)大鼠30只，体质量(200±20) g，购自安徽医科大学动物实验中心。温度：(25±1)℃，湿度：40%～75%，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 HDND-XIV由安徽医科大学药学院提供，浓度为0.1 mol·L-1；弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant，FCA)及噻唑蓝MTT购自美国Sigma公司；澳洲胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；高糖DMEM购自Hyclone公司；lipofectamine 2000转染试剂盒及Opti-MEM购自Invitrogen公司；MeCP2抗体及Shh抗体购自Abcam公司；β-actin抗体购自北京中杉金桥公司；Gli1及PTCH1抗体购自北京Bioss公司；IL-6、TNF-α、IL-1β酶联免疫试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)购自武汉Elabscience公司；辣根标记山羊抗兔IgG及辣根标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。

2 方法

2.1 动物模型的制备 实验动物随机分为正常组、AA组，每组15只。适应性喂养1周后，每只大鼠左后足趾皮内注射FCA(0.01 ml·kg-1)，制备AA大鼠，即模型组大鼠。左后足趾皮内注射等量的PBS，作为正常对照组大鼠。

2.2 原代FLS的提取与培养 造模24 d后将大鼠处死，在新洁尔灭溶液中浸泡约15 min，沿膝关节正中纵行切开并分离肌肉，关节囊的滑膜层和纤维层，取出滑膜组织，每只大鼠可采集15 mg～20 mg。将取出的滑膜组织用Hank′s液反复洗3次，洗至白色再在DMEM中清洗3次。剪成1 mm3的小块，剪的过程中保持组织块的湿润。将细胞培养瓶底板浸润DMEM培养基，用吸管分别将剪成小块的组织均匀地平铺在底板上，加入含FBS的DMEM培养基，FBS的体积分数为0.2。培养瓶倒置于37 ℃培养箱中培养6～8 h后，正置继续培养，3 d后可观察到个别组织周围出现稀少的滑膜细胞，此时换液。6 d后个别组织周围细胞生长紧密，即可除去组织。9 d后传代，为第1代FLS细胞，消化细胞并进行培养，实验所用FLS为3代～5代。

2.3 半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration， IC50)的检测

2.3.1 MTT法检测HDND-XIV的IC50值 实验分组，正常FLS组：与AA FLS做对照；AA FLS组：与HDND-XIV处理组作对照；HDND-XIV处理组：400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1。实验重复3次。

2.3.2 步骤 将对数生长期的FLS消化成细胞悬液，以2×104个/孔的密度接种于96孔板中，37 ℃过夜。细胞贴壁后各浓度组加入HDND-XIV刺激，作用48 h后将孔内液体换成无血清的培养基，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，37℃作用4 h。然后将孔内液体吸净，每孔加入150 μL DMSO，室温震荡后，将96板放在酶标仪上检测吸光度(A)，波长为490 nm。

2.4 ELISA分析IL-6、TNF-α、IL-1β水平 将对数生长期FLS消化成细胞悬液并接种于24孔板内，每孔1×106个，待细胞长满时，分别加入不同浓度的HDND-XIV进行刺激，每组3个复孔。实验分组为正常组，AA组，AA加HDND-XIV组(80、40、20、10、5 μmol·L-1)。HDND-XIV作用24 h后，吸取细胞培养基上清，4℃，3 000 r·min-1，离心1 min, 收集上清液，ELISA法检测炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。

2.5 Western blot检测MeCP2、PTCH1、Gli1和Shh 将对数生长期FLS接种于6孔板中，待24 h贴壁后，每孔内加入2 mL DMEM，并在AA组上加HDND-XIV刺激，分正常组、AA组、AA加HDND-XIV组(10 μmol·L-1)。作用48 h后，每孔加250 μL RIPA裂解液(1 mL裂解液中加10 μL PMSF)，冰上裂解30 min，将裂解的混合物移到EP管中。4℃，12 000 r·min-1，离心30 min，离心结束后移取上清至新的EP管中，加入蛋白上样缓冲液，100℃恒温10 min使蛋白变性。将提取的蛋白样品每孔上样15 μL，进行电泳分离，并转膜到PVDF膜上。在体积分数为0.05的脱脂奶粉下封闭2 h，TBST漂洗3次后，于4 ℃中孵一抗过夜。一抗稀释的比例为：PTCH1(1 ∶200)、MeCP2(1 ∶1 000)、Gli1(1 ∶200)、Shh(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)。在TBST漂洗3次后，加入和一抗匹配的二抗(1 ∶10 000)，孵育1 h，再在TBST中漂洗3次，用ECL发光试剂盒进行显影。

安：我更喜欢纽约施坦威，尽管在纽约琴上演奏更具挑战，但他们的声音更符合我的审美。于我而言，纽约琴有一种更暗、更柔和的声音，我非常喜欢纽约琴的低音部分。

2.6 焦磷酸测序分析 使用Axygen DNA提取试剂盒提取出基因组DNA，并用亚硫酸盐对DNA进行修饰。PTCH1引物序列上游引物：5′-AGTTGGGAGTTTTTTAGATGATAGG-3′，下游引物：5′-CCAA AAAACCCCACCTTAATCTCTTTCA-3′，PTCH1测序引物：5′-GGAGTTTTTTAGATGATAGGTTTA-3′，扩增后，使用QIAGEN焦磷酸测序仪测序。

2.7 过表达质粒GV230-MeCP2的转染 使用脂质体(lipofectamine 2000)转染过表达质粒GV230-MeCP2入AA FLS，对照组AA FLS转染空载体GV230。转染前1天，将FLS接种于6孔板中，加入含FBS的DMEM培养基，在37℃培养箱中培养。待细胞快长满时，即可用于实验。取5 μL质粒与200 μL Opti-MEM轻柔混合，温室孵育5 min，同时另取 5 μL脂质体同样与200 μL Opti-MEM轻柔混合并孵育5 min。将上述两种混合液轻柔混合，并在室温孵育25 min，形成复合体。取出6孔板，弃去原培养基并用PBS清洗3次，每孔加入1.6 mL Opti-MEM，将上述孵育好的复合体，轻揉均匀的加入相应的孔中并混合均匀，置于37℃培养箱中培养6 h后，换成含FBS的DMEM培养基继续培养。对照组操作方法同上。

3 结果

3.1 不同浓度的HDND-XIV对FLS增殖的影响 由Fig 2的MTT分析可知，AA组FLS的吸光度值大于正常组FLS，且差异具有统计学意义(P<0.01)，说明AA组的增殖速率大于正常组。加入不同浓度的HDND-XIV(400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1)刺激48 h后，随着HDND-XIV浓度的减小，吸光度值在增加(P<0.01)，说明HDND-XIV具有一定的毒性，并根据吸光度值计算出IC50值为161 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of HDND-XIV on

Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3～8：400，200,100,50,25,12.5 μmol·L-1HDND-XIV treated AA group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsAA group

3.2 不同浓度的HDND-XIV抗炎活性的筛选 鉴于HDND-XIV毒性，在小于0.5倍的IC50范围里，如Fig 3，选择5个浓度点(80、40、20、10、5 μmol·L-1)，在AA组FLS上进行HDND-XIV抗炎活性的筛选，结果表明AA组FLS细胞上清中IL-6，TNF-α，IL-1β分泌大于正常组(P<0.01)，且差异具有统计学意义，随着HDND-XIV浓度的减小，其分泌在一定范围内呈下降的趋势(P<0.01，P<0.05)，当HDND-XIV浓度为10 μmol·L-1时，含量最低。

3.3 HDND-XIV对PTCH1，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表达的影响 根据ELISA筛选的结果，在AA组FLS上加HDND-XIV刺激，刺激浓度为10 μmol·L-1。如Fig 4所示，与正常组FLS相比，AA组FLS中PTCH1的表达下降(P<0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表达升高(P<0.01)，并差异具有统计学意义。加入HDND-XIV以10 μmol·L-1浓度刺激48 h后，相比较AA组FLS，AA加HDND-XIV组中PTCH1蛋白表达升高(P<0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表达下降(P<0.01)，差异具有统计学意义。

3.4 PTCH1基因启动子的焦磷酸测序 以10 μmol·L-1的浓度，在AA组FLS上加 HDND-XIV刺激，分正常组，AA组，AA加HDND-XIV组。刺激48 h后，提取FLS的基因组DNA，用焦磷酸测序进行检测，结果如Fig 5。每组均检测了4个位点，正常组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为0%、9%、41%、0%；AA组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为63%、67%、62%、63%；AA加HDND-XIV组PTCH1基因启动子4个位点Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分别为28%、32%、48%、26%。根据文献指出[12]，50%以上定义为高甲基化，20%～50%定义为低甲基化，20%以下定义为无甲基化。正常组Pos.1、Pos.2、Pos.4位点的甲基化程度分别为0%、9%、0%，视为无甲基化；AA组Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位点均高于50%，视为高甲基化；AA加HDND-XIV组Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位点均在20%～50%，视为低甲基化。说明AA组FLS甲基化程度高于正常组(P<0.01)，经HDND-XIV刺激后，AA组甲基化程度降低(P<0.01)。

Fig 3 Effect of HDND-XIV on level of IL-6(A)，

Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3～7：80，40,20,10,5 μmol·L-1HDND-XIV treated AA group.**P< 0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAA group

Fig 4 Effect of HDND-XIV on PTCH1，MeCP2,

A,B,C:the protein expression of PTCH1，MeCP2，Shh and Gli1；HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsAA group

3.5 转染过表达质粒对MeCP2、PTCH1、Gli1和Shh蛋白表达以及炎症因子IL-6，IL-1β，TNF-α的影响 在AA FLS中转染GV230-MeCP2过表达质粒，对照AA FLS组转染GV230空载体，转染成功后均加入HDND-XIV，HDND-XIV的终浓度为10 μmol·L-1。分组如Fig 6，结果显示成功转染GV230-MeCP2，MeCP2表达上升，且与AA组MeCP2表达无差异，但与AA加HDND-XIV组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，说明过表达成功。成功过表达MeCP2后，相比较AA加HDND-XIV组，PTCH1蛋白表达下降(P<0.01)，Gli1和Shh蛋白表达增加(P<0.01)，并且炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌也增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。

Fig 5 PTCH1 gene promoter methylation level

A:PTCH1 gene promoter methylation level.B:Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3：HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAA group

Fig 6 AA-FLS transfected with plasmid ±s,n=3)

The MeCP2, PTCH1, Gli1 and Shh protein expressions was detected by western blot(A,B,C) and the level of IL-6，IL-1β，TNF-α was detected by ELISA(D) Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3：HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group；Lane 4：HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230-MeCP2 treated AA group；Lane 5：HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230 treated AA group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAA group

4 讨论

RA是一种滑膜炎症疾病，其发病机制尚不清楚。炎症因子被认为是发病不可缺少的一部分，其在类风湿关节炎中的紊乱会造成炎症性的关节损伤[13]。本实验在体外采用MTT和ELISA证明了HDND-XIV具有明显的抗炎活性，并对HDND-XIV产生抗炎作用的机制经行了探究。橙皮素是二氢黄酮的一种，为了克服其较低的生物利用度，本实验室合成了一系列橙皮素衍生物，前期预实验初步证明HDND-XIV可能具有良好的抗炎活性，MTT法检测6个不同HDND-XIV浓度点对AA FLS的影响，显示HDND-XIV具有一定的毒性。炎症指标的高低可以反映药物的抗炎活性，鉴于HDND-XIV的毒性，在小于0.5倍IC50范围里选择5个浓度点加药刺激，检测各组炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量，显示随着HDND-XIV浓度的降低，细胞培养基中IL-6、TNF-α、IL-1β的浓度呈现下降的趋势，HDND-XIV浓度为10 μmol·L-1时含量最低，说明此时HDND-XIV的抗炎活性最强。

文献报道，Hedgehog信号通路在组织修复以及持续的慢性炎症中发挥着重要作用[14]。因此，实验中检测了Hedgehog信号通路相关蛋白的表达来探究HDND-XIV发挥抗炎作用的机制。Western blot(Fig 4)的结果显示，经HDND-XIV作用后，AA FLS中PTCH1蛋白表达增加，Gli1和Shh蛋白表达减少，说明AA FLS中Hedgehog信号通路可能受到了HDND-XIV的抑制。蛋白质的表达受到多种因素的影响，如转录、翻译等环节，其中DNA甲基化是表观遗传学修饰的一种，可以抑制基因的转录，阻止蛋白的表达。有研究表明特定基因的甲基化参与了RA的发病[4,15]。在RA中，不同基因的甲基化状态和程度有所不同。一些基因，如凋亡诱导基因，抗炎因子基因发生高甲基化，导致其基因表达水平降低，促进了RA的发病。另外一些基因，如促炎因子基因甲基化水平降低，导致其表达水平上升，促进RA的发病。为了探究HDND-XIV是否通过调控PTCH1基因的甲基化，从而增加PTCH1蛋白的表达，产生抗炎作用。本研究采用了焦磷酸测序技术定量检测了各组PTCH1基因的甲基化程度。结果显示AA FLS中PTCH1基因的甲基化程度明显高于正常组FLS，表现为高甲基化状态，经HDND-XIV刺激后，PTCH1基因甲基化程度明显降低，表现为低甲基化状态。说明HDND-XIV可能是通过抑制PTCH1基因甲基化，增加PTCH1蛋白的表达产生抗炎作用。文献报道MeCP2与DNA甲基化密切相关，其可以特异性的识别和绑定在甲基化的DNA序列上,从而抑制基因的表达[5]。MeCP2的增多反映甲基化水平发生整体的上调。为了探究HDND-XIV是否通过作用于MeCP2来调控PTCH1基因的甲基化，我们在AA FLS上转染过表达质粒GV230-MeCP2，然后再加入HDND-XIV，显示成功过表达MeCP2后，PTCH1蛋白表达明显减少，Gli1和Shh蛋白表达增加，说明Hedgehog信号通路被激活，同时该组的细胞培养基中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量较AA FLS加HDND-XIV组也增加。说明HDND-XIV可能是通过下调MeCP2蛋白的表达，使PTCH1基因甲基化程度降低，增加了PTCH1蛋白的表达，抑制了炎症因子的释放。

综上所述，HDND-XIV可在体外抑制FLS的炎症，其抗炎的作用可能与抑制PTCH1基因甲基化有关，通过下调MeCP2蛋白的表达，使PTCH1基因的甲基化程度降低，增加PTCH1蛋白的表达，从而抑制了Hedgehog信号通路，下调了炎症指标。提示HDND-XIV可能是通过调控特定基因的甲基化缓解FLS的炎症，初步说明HDND-XIV治疗RA有一定的疗效。本实验探讨了HDND-XIV对AA大鼠FLS炎症的影响及可能的分子机制，使橙皮素类药物在临床的应用等方面具有积极的意义。

(致谢：本实验在安徽医科大学药学院科教大楼实验室完成，特别感谢我的导师李俊教授给予我细心的指导与教诲，感谢我的师兄师姐，在实验进展与论文撰写中给予我帮助，在此一并表达我诚挚的谢意。)

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Effect of Hesperidin derivative-XIV regulating methylation of PTCH1 gene on FLS inflammation of adjuvant arthritis rats

SUN Zheng-hao1,2,3, LIU Yan-hui1,2,3, LIU Jun-da1,2,3, Xu Dan-dan1,2,3,LI Xiao-feng1,2,3,ZHANG Yi-long1,2,3,MENG Xiao-ming1,2,3, HUANG Cheng1,2,3, LI Jun1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,theKeyLaboratoryofMajorAutoimmuneDiseasesofAnhuiProvince,AnhuiInstituteofInnovativeDrugs,Hefei230032，China;2.TheKeyLaboratoryofAnti-inflammatoryandImmunemedicines，MinistryofEducation,Hefei230032，China;3.InstituteforLiverDiseasesofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230032，China)

Aim To explore the effect of 5-(4-Chlorophenethyl) imino-7-O-acetyl-4-chlorophenethylamine hesperetin(HDND-XIV) on fibroblast-like synoviocytes(FLS) inflammation in adjuvant arthritis(AA) rats and the underlying molecular mechanism.Methods AA rats were induced by Freund′s complete adjuvant(FCA，0.01 ml·kg-1)，after 24 d，the rats were killed and the synovial tissue was used to extract primary cells；MTT was used to detect the half maximal inhibitory concentration(IC50) of HDND-XIV；Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the level of interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-1β(IL-1β) in cell culture. Lipo-fectamine2000 transfection kit was used to display the overexpression of MeCP2 in AA FLS. Western blot was used to detect the expression of MeCP2，PTCH1，Gli1 and Shh. Pyrosequencing was used to detect the methylation level of the PTCH1 gene quantificationally.Results The IC50of HDND-XIV on FLS was 161 μmol·L-1through MTT. The most significant anti-inflammatory concentration was 10 μmol·L-1through ELISA. In AA FLS，the expression of PTCH1 was increased and MeCP2，Gli1，Shh were reduced in response to HDND-XIV. According to pyrosequencing，the methylation level of the PTCH1 gene was significantly decreased in response to HDND-XIV. Overexpression of MeCP2 in AA FLS followed by treating with HDND-14，the expression of PTCH1 was reduced，the expression of Gli1，Shh was increased and the level of IL-6, IL-1β, TNF-α rose.Conclusion HDND-XIV has prominent anti-inflammatory activity in FLS，the mechanism of which may be associated with inhibiting the expression of MeCP2 to reduce the methylation status of PTCH1 gene.

HDND-XIV；Sprague Dawley rats；adjuvant arthritis；methylation；Hedgehog；fibroblast-like synoviocytes；overexpression；inflammation

时间：2017-5-25 17:44 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.018.html

2017-01-13，

2017-02-20

国家自然科学基金资助项目(No 81273526，81473268)；安徽省教育厅重点基金项目(No KJ2016A364，KJ2016A365)；安徽省自然科学基金面上项目(No 21408085MKL31)

孙正浩(1992-)，男，硕士生，研究方向：抗炎免疫药理学,E-mail：sunzhenghao1992@163.com； 李 俊(1960-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：抗炎免疫药理学，通讯作者，E-mail: lijun@ahmu.edu.cn，ayidasunzhenghao@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.009

A

1001-1978(2017)06-0781-07

R-332；R285.5；R364.5；R392.12；R394.2；R593.22