紫外光谱法结合化学计量学用于环境水样中2，4，6—三硝基甲苯及其分解物的同时测定

王露+熊庆+郭彩红+李梦龙+蒲雪梅

摘 要 结合紫外吸收和偏最小二乘法建立了环境水样中2，4，6三硝基甲苯及其分解物的分析方法，在不经过任何预先分离的情况下，实现了环境水样中2，4，6三硝基甲苯（TNT）及其分解物2，4二硝基甲苯（2，4DNT）和2，6二硝基甲苯（2，6DNT）的快速准确测定。采用正交试验设计（OAD）配制了25个训练集样本和15个独立预测集样本，采用变量种群分析（VCPA）方法挑选特征变量以提高偏最小二乘法（PLS）模型的预测效果，预测集中每个物质的相关系数R2均达到0.99。将最优的VCPA模型用于真实水样中TNT以及DNT的检测，并采用HPLC方法进行了验证。实验结果显示，VCPA模型的回收率与HPLC法相近。紫外光谱法结合化学计量学方法可作为环境体系中多成分同时测定的一种简便、快速、有效的方法。

关键词 三硝基甲苯； 二硝基甲苯； 紫外光谱； 化学计量学； 环境水样

1 引 言

2，4，6三硝基甲苯（TNT）在军事和商业中[1]应用广泛。研究表明，TNT可引起生物体中毒[2～4]，而二硝基甲苯（DNT）是TNT的主要分解物，也是涂料、橡胶和颜料等物质生产的中间物[5，6]，该类污染物在环境水中浓度可达ng/L到 mg/L[7]，长时间接触痕量的DNT会影响生物体的生长和存活[8，9]。因此，检测环境水中TNT和DNT具有重要意义。

文献报道的用于检测空气、水和土壤中TNT及DNT含量的方法，包括荧光光谱法[10]、表面增强拉曼光谱法（SERS）[11，12]、气相色谱结合电子捕获检测法（GCECD）[13]、气相色谱质谱联用法（GCMS）[14]和高效液相色谱法（HPLC）[1，15]。这些方法选择性和灵敏度较高，但是大多需要昂贵的仪器，样品前处理过程复杂，耗时长，因此，发展快速、简单和准确的TNT及DNT定量方法具有重要的实用价值。

紫外吸收法是一种简单、快速、准确的定量分析方法[16]，但选择性不高。如果样本中物质相似或者未知干扰存在的情况下，吸收光谱会发生重叠，影响其准确测量，因此限制了它在一些复杂体系中的应用。化学计量学可以利用数学分离代替化学分离来解决光谱重叠的问题[17，18]，其中偏最小二乘法是功能强大的多元统计方法，在样本数量较少、光谱重叠的情况下，可以实现定量定性分析[19，20]。研究表明，通过消除一些干扰变量或者挑选一些包含重要信息的变量，可以显著提高模型的效果[21，22]，如竞争性自适应权重取样法（CARS）[23]、迭代偏最小二乘（iPLS）[24]、变量消除法（UVE）[25]、遗传算法（GA）[26]、迭代保留信息变量法（IRIV）[27]。最近，Yun等[28]提出了一种新的变量挑选方法，即变量结合种群分析法（VCPA），该方法可充分利用子集之间的统计信息和变量间的相互关联，在处理近红外光谱数据时，VCPA方法比CARS、MCUVE、IRIV方法更具有优势。

TNT分解物中，2，4DNT和2，6DNT受到研究者的广泛关注[29，30]，但是目前尚未有结合计量学进行分析检测的相关报道。本研究选择TNT以及2，4DNT和2，6DNT作为环境水中炸药及其分解物的代表物质，结合化学计量学和紫外光谱法对其进行同时定量测定。采用正交设计方法制备了一系列三组分混合物样本，其中25个作为训练集，15个作为独立预测集，此外还预测了四类真实水样（共8个样本）。比较了全谱和变量挑选两种建模方法的预测结果，选取每个物质的最优模型用于真实水样中目标物的预测，并采用HPLC方法对模型的实用性和准确性进行了验证。研究结果表明，紫外光谱法结合变量挑选模型在复杂体系目标物同时测定中具有良好的应用潜力。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Hitachi U2900型紫外分光光度计、 SHIMADZU LC20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱条件：流动相为乙腈水（30∶70， V/V），等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长254 nm，整个分离过程由CBM20Alite系统控制。

TNT（中国银光化学试剂厂）； 2，4DNT和2，6NDT分析标准品（Aladdin公司上海）；乙腈（色谱纯，成都科龙化学试剂厂）。实验用水均为超纯水。标准工作溶液：准确称取适量的TNT，2，4DNT和2，6DNT固体粉末，用乙腈溶解并定容，终浓度为200 μg/mL。

2.2 紫外吸收法测定单组分硝基苯

采用单组分校正法确定紫外吸收法测定TNT和DNT的线性范围。配制系列浓度的工作溶液。以溶剂为空白，测量各工作溶液在200～400 nm范围内的紫外吸收光谱。根据各分析物在最大吸收波长下对应的吸光度与样品浓度构建立校正曲线，得到测定TNT，2，4DNT和2，6DNT的线性范围。

2.3 样本配制

采用三因子五水平的正交试验设计（OAD）[31]配制25个训练集样本，15个独立测试样本。为了验证本方法的实用性，收集了自来水（四川大学化学馆）、池水（四川大学望江校区）、河水1（府南河，成都九眼桥）和涂料厂附近的河水2（江安河，双流蛟龙港）4种水样，分别用0.45 μm滤膜过滤。每种水样配制两个样本。各样本均加入适量TNT，2，4DNT和2，6DNT （浓度均在线性范围内），模拟真实环境水样，每个样本光谱平行测定3次。表1列出了训练集样本（1～25号样本）、独立测试集（26～40号样本）以及真实水样（自来水41～42，池水43～44，河水1 45～46， 河水2 47～48）浓度配比。

2.4 化学计量学方法

偏最小二乘（PLS）算法通过最大化光谱矩阵X与目标物质浓度矩阵y之间的协方差为目标，逐一求解模型中的各个潜变量。将光谱数据矩阵与样本各组分浓度矩阵之间的内在联系关联起来，使校正模型更为稳健。在面临样本数目少而特征变量较多的问题时，可以有效提取有用化學信息。

变量模型种群分析（VCPA）[28]是一种结合模型种群分析和指数递减函数迭代进行变量挑选的方法，将挑选出来的变量用PLS建模。具体步骤如下： （1）随机将光谱变量建立K个子集，并对这K个子集建立K个PLS子模型； （2）统计K个子模型的评价参数，选取效果最好的前5%的子模型； （3）将前5%的子模型中的变量进行权重统计，通过指数递减函数强制删除权重较低的变量； （4）确定剩下变量的最佳组合。

本研究采用以下指标对模型进行评价：校正集均方根误差（RMSEC）、预测集均方根误差（RMSEP）、相关系数（R2），其计算公式如下：

所有数据处理及计算在MATLAB（Version 2013a， Math work， Inc）环境下完成，PLS和VCPA算法代码来自于中南大学中药现代化研究中心。

3 结论与讨论

3.1 紫外光谱表征

TNT，2，4DNT和2，6NDT的紫外吸收光谱（图1）最大吸收波长分别位于228、245和236 nm，3个物质的吸收光谱存在严重的光谱重叠，在不经过预分离的情况下，使用传统校正方法难以准确分析3种物质的混合物。 因此，引入化學计量学模型，通过数学分离代替化学分离来解决光谱重叠的问题。

按照2.2节中方法，建立了紫外光谱法分别测定单组分TNT，2，4DNT和2，6NDT的标准曲线方程，表2列出了单组分测定的一些特征参数。

表1中的参数是没有经过任何预处理的样品得到的结果，虽然与文献报道的一些TNT和DNT测定方法[3234]相比，检测限和线性范围的浓度偏高，但完全可以满足国家标准的测定需求（国家《污水综合排放标准》[35]中规定第二类污染物最高允许排放浓度硝基苯类为：一级标准2.0 mg/L、二级标准3.0 mg/L、三级标准5.0 mg/L）。

3.2 全谱偏最小二乘模型

为了建立可靠、准确和稳定的模型，本研究用了两种光谱预处理方法（SG平滑，一阶导数）处理原始光谱数据，并与未经处理的数据进行建模结果对比。因此，对于每个目标物而言，共建立了3个全谱模型。五倍交叉验证用于评估模型的质量。表3列出了PLS全谱模型的建模结果。

由表3可知，对于TNT和2，4DNT， 经过SG平滑预处理的数据建模结果较好，然而对于2，6DNT而言，一阶导数处理的数据建模效果更好。通过比较RMSEP和R2发现，全谱PLS建模预测TNT和2，6DNT的R2<0.98，并不理想，这可能是因为全谱数据中包含较多的无信息变量，因此进一步采用变量种群分析（VCPA）方法来去除无信息变量，提高模型的预测结果。

3.3 变量挑选模型

同样采用三种光谱数据（原始，SG平滑和一阶导数）对每个物质建立了三种VCPA模型，预测结果见表4。比较表3和表4的结果可以发现，虽然VCPA模型挑选出来的变量个数只有10个左右，但是每一个物质预测结果的R2>0.98，高于没有变量挑选的PLS模型，表明通过有效变量的挑选可以提高模型的准确率。最后得到了每个物质的最优模型为：TNT，VCPA+SG平滑；2，4DNT，VCPA+SG平滑；2，6DNT，VCPA+一阶导数。

3.4 环境水样的检测

为了验证上述最优模型的应用性和可靠性，将构建的最优模型用于4种环境水的8个样本（每种水样取两个样本）中TNT、2，4DNT和2，6DNT的浓度预测，并同时采用HPLC方法进行验证。表5总结了环境水样的全谱PLS、VCPA和HPLC方法的测定结果。

图2A显示了真实样本的紫外吸收光谱图，2A中插图为未加入TNT，2，4DNT和2，6DNT的自来水、湖水和河水的紫外吸收光谱图。在200～230 nm波长范围内有较强的未知背景吸收，而这个区域也是3个目标物的主要光谱信息区。这种背景干扰导致了全谱PLS模型的预测效果较差，3个目标物质的回收率分别在60.8%～155.2%、73.2%～174.6%和47.2%～141.0%。然而，尽管真实水样中存在较大的未知干扰和目标物的光谱重叠，VCPA建模却可以通过消除无信息变量和干扰变量仍然取得了满意的结果，呈现出强的抗干扰能力，其预测值与真实值和HPLC测定值非常接近，VCPA模型的平均回收率分别为97.5%、99.1%和98.6%，HPLC方法的平均回收率分别为104.7%、101.0%和102.2%。

图2B～图2D显示了VCPA挑选出来的光谱点，其中a， b分别代表TNT，2，4DNT和2，6DNT之间的差谱[36]，蓝色和红色点为VCPA挑选出来的变量点。图2B～图2D的结果显示：VCPA模型挑选出来的光谱点主要分布在3种分析物的强吸收区域220 nm～300 nm之间，是属于苯环的ππ*跃迁的主要吸收带区域。 差谱图显示， 大多数VCPA光谱点分布在每种分析物与其它两种物质的差谱峰附近，表明挑选出来的光谱点大多位于这些分析物差异较大的区域。虽然VCPA挑选出来的少量点也位于3种分析物的弱吸收区域（300～400 nm），并且差谱的差异也比较小，但这些点也同时位于环境水背景吸收弱的区域，并且VCPA测试结果显示这些点对这3种物质的同时定量有一定贡献。上述分析证明了复杂体系中特征变量挑选的重要性，可以通过变量挑选来降低干扰，明显提高预测结果的准确性。

4 结 论

结合紫外吸收与化学计量学中的PLS方法提出了一种简单、快速、有效的分析方法，可以在不经过任何预分离的情况下准确地测定环境水样中的TNT及其分解物（2，4DNT和2，6DNT）的含量。本研究建立了两种模型：全谱PLS模型和变量挑选VCPA模型，用于预测独立测试集和环境水样中目标物的含量，并用HPLC方法作为参照。通过对比两种模型和HPLC的测定结果发现，全谱PLS模型在存在干扰的环境水样中预测准确度低，而VCPA变量挑选方法通过有效地选出重要特征变量，剔出无信息变量，所以在存在未知干扰的情况下依然可以取得准确的结果，VCPA模型对每个目标物的相关系数R2>0.99， 真实环境水样目标物的回收率为101.0%～104.7%，与HPLC方法的结果相近，显示出了良好的实际应用潜力。本研究结果表明，紫外光谱法与化学计量学方法相结合的分析策略，可以为环境中炸药及相关物质的定量检测提供一种简便有效的分析方法。

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