磷脂微乳电动色谱的定量结构保留关系研究

宋静+郑园+霍长虹+刘建芳

摘 要 以大豆磷脂为主要的表面活性剂，制备适合毛细管电动色谱使用的不同构成比的微乳体系， 应用溶剂化参数模型研究了中性溶质在其中的定量结构保留关系。使用动态涂层毛细管， 以二甲基亚砜和十二烷基苯分别作为电渗流和微乳液滴迁移的标记物， 测定了26个具有不同结构小分子中性化合物在17种微乳电动色谱体系下的保留因子， 建立了线性溶剂化能量关系（LSER）方程。通过比较两体系的LSER方程系数比较体系相似性。结果表明， 本研究建立的磷脂微乳电动色谱体系在线性溶剂化特征上和其它构成的微乳电动色谱体系相似。对溶质保留贡献较大的是溶质体积和有效氢键碱度， 油相种类及浓度对溶质的保留选择性无明显影响。

关键词 微乳电动色谱； 大豆磷脂； 保留因子； 线性溶剂化能量关系

1 引 言

微乳电动色谱（Microemulsion electrokinetic chromatography， MEEKC）是使用微乳作為分离介质的电泳技术， 具有分离效率高、适用范围广和样品消耗少等优势， 已广泛应用于分离科学领域[1，2]。中性物质在MEEKC系统中依据其在水相和假固定相（微乳液滴）的分配系数不同而实现分离， 而带电物质除了在两相间的分配系数不同外， 还有物质间的静电作用。MEEKC的选择性通过假固定相的改变实现， 不同的表面活性剂、油相、助表面活性剂和有机改性剂的加入都会改变微乳对分离物的选择性。尽管MEEKC的应用已有20余年， 已有许多关于微乳体系构成的报道[3]， 但最常用的仍是以十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate， SDS）作为表面活性剂制备的微乳。Lucangioli等[4，5] 最初将磷脂类生物表面活性剂引入MEEKC体系中， 并将其应用于免疫抑制剂倍他米松及其衍生物的正辛醇/水分配系数（nOctanol/water partition coefficient， lgP）测定， 发现用磷脂类生物表面活性剂制备的微乳体系预测以上药物的lgP值更准确。但是该研究仅检测了4种药物， 且未见应用该系统进行其它药物集合lgP值测定的报道， 因此磷脂类微乳电动色谱体系提高药物lgP值预测准确性的结论尚不十分肯定。磷脂类微乳与其它构成的微乳体系是否存在保留机制的差别也未见报道。

线性溶剂化能量关系（Linear solvation energy relationship， LSER）模型广泛用于各种色谱体系的溶质保留机制研究[6～8]以及正辛醇水分配系数[7]和药物体内透膜过程的预测[9，10]。通过方程系数间的比较， 可以发现不同分配体系的相似性， 选择合适的色谱体系用于药物膜通透性的筛选[7，11]。本研究采用LSER模型， 对应用大豆磷脂制备的微乳体系进行MEEKC分离时的溶质保留机制进行研究， 比较了不同磷脂构成比、不同油相及油相含量对LSER方程系数的影响， 同时将磷脂微乳体系与其它表面活性剂构成的微乳或胶束体系进行了比较， 拟阐明磷脂类成分和油相组分在微乳分离体系中的作用， 为进一步应用磷脂类微乳电动色谱体系进行药物膜通透性的预测提供理论依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪、DAD检测器（美国Beckman公司）；弹性石英毛细管柱（河北永年光导纤维厂， 60 cm×50 μm， （id）， 有效长度50 cm）；Malvern Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射仪（英国Malvern公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）； pH3C型pH计（上海雷磁仪器厂）

十二烷基硫酸钠（石家庄市拜昂生物技术有限公司）；聚凝胺（PB， 美国Sigma公司）；葡聚糖硫酸盐（DS， 美国Sigma公司）；大豆磷脂（注射级， 上海太伟药业股份有限公司）；胆酸钠（美国Sigma公司， BioXtra ≥ 99%）；脱氧胆酸钠（SigmaAldrich 公司）；十七氟辛烷磺酸四乙基铵盐（Aldrich 公司）；十六烷三甲基溴化铵、十二烷基苯（Sigma公司）；肉豆蔻酸异丙酯（上海源叶生物科技有限公司）；正丁醇、正辛醇、正庚烷（分析纯， 天津市永大化学试剂有限公司）；全氟辛基磺酸钾（Aldrich 公司）；二甲基亚砜（DMSO， 分析纯， 天津市标准科技有限公司）；甲醇（色谱纯， 天津市康科德科技有限公司）；实验用水为某品牌纯净水。

待测化合物见表1， 其中间二甲苯、对二甲苯由河北科技大学提供， 其余均由河北医科大学药学院提供。

2.2 微乳和化合物储备液的制备

优化的微乳处方构成见表2。称取适量的表面活性剂于密封性容器内， 用水相（20 mmol/L NaH2PO4）溶解， 依次加入助表面活性剂、油相， 混匀、超声30 min， 室温静置（12 h 以上）至微乳溶液摇晃后仍澄清， 表明形成稳定微乳， 最后用饱和NaOH调至所需pH值， 备用， 使用前用0.45 μm滤膜过滤。

根据Vitha等[12]对建立溶剂化方程的溶质集合筛选提出的指导原则， 共收集了26个具有不同结构特征的小分子中性化合物及其Abraham分子描述符（见表1）， 分别用甲醇溶解， 配制成3～100 mg/mL储备液， 进样前用微乳液稀释至0.1～3 mg/mL。

1 mL微乳液中加入6 μL苯甲酰胺甲醇溶液（30 mg/mL）、6 μL邻甲苯胺甲醇溶液（100 mg/mL）、4 μL 2萘酚甲醇溶液（100 mg/mL）和6 μL 电渗流标记物DMSO、4 μL 微乳标记物十二烷基苯， 作为标准混合液。

2.3 保留因子的测定

2.3.1 毛细管预处理 （1）毛细管活化 用甲醇冲洗新管3 min， 再依次用水冲洗0.5min、 0.1 mol/L HCl 冲洗15 min、水冲洗0.5 min、1 mol/L NaOH 冲洗15 min。（2）毛细管涂层 毛细管活化后静置30 min， 先用5% PB溶液冲洗20 min， 静置20 min后， 再用3%DS溶液冲洗20 min， 静置30 min， 使用前用水冲洗5 min即可。

2.3.2 测定条件 毛细管柱总长度60 cm（有效长度50 cm， 内径50 μm）， ±20 kV恒压分离， 检测波长208 nm， 压力进样（0.8 psi， 8 s）， 柱温25℃。

2.3.3 不同MEEKC体系下保留因子的测定与计算 阴离子型微乳（表2中ME1ME16）采用+20 kV电压， 阳离子型微乳（表2中ME17）采用20 kV电压分离， 柱温25℃。保留因子k按下式计算 [13]：

2.3.4 保留因子与Abraham描述符间LSER的建立 LSER理论是基于腔穴模型， 解释溶质在两相间转移[14]， LSER方程一般描述如下：

SP作为给定系统的一种溶剂化性能， 例如溶剂的保留行为的对数（lgk）、正辛醇/水分配系数（lgP）、稳态血脑药物浓度比（lgB）等；方程中的大写字母是Abraham溶质描述符， E表示摩尔折射率， S表示溶质偶极/极化率， B和A分别表示有效氢键碱度和酸度， V代表特征体积；小写字母 e， s， a， b和v是通过多元线性回归得到的各个变量的系数， 反映了给定系统的性质即溶剂化参数对系统的贡献大小， 其中e代表分配系统中的溶质分子与溶剂的π或n电子的作用；s反映系统两相间的偶极/极化率；b和a分别代表系统的有效氢键碱度和酸度；v代表系统的空穴的形成能力或内聚能；常数c是方程的截距， 由溶质和系统间恒定的相互作用产生， 如相体积比。

本研究将不同微乳体系下测得的26个化合物的保留因子（lgk）与Abraham描述符间建立了LSER方程。

3 结果与讨论

3.1 微乳体系构成

通过改变表面活性剂及油相的种类和浓度制备的稳定微乳处方组成见表 2。

文献[15]报道， 制备微乳时各组分的加入顺序会影响微乳的形成， 但是本实验发现， 超声和静置有助于微乳的形成， 即使改变组分的加入顺序， 仍能够形成稳定的微乳体系。微乳制备和保存都应在密封的容器内进行， 以防止油相和丁醇等成分的挥发影响微乳的构成。运行MEEKC时， 洗脱时间窗口的大小与微乳中助表面活性剂及表面活性剂的浓度相关， 本研究控制时间窗都在20 min以上， 以保证洗脱窗内能够容纳较多的溶质。

3.2 微乳稳定性

通过外观、粒径和电位变化考察了微乳的稳定性， 部分检测结果见表3。从表中粒径和Zeta电位值可知， 微乳室温存放30天， 粒径和表面电位无明显变化。

3.3 溶质保留时间和保留因子重现性

以ME5为电动色谱流动相， 用标准混合液进样， 考察动态涂层条件下溶质保留时间的重复性， 图1是典型的色谱图。结果表明， 应用文献[16]报道的涂层方法（见2.3.1节毛细管涂层）， 使用同批次微乳液， 连续测定3天， 总进样60针（每针运行时间在20 min以上）， 化合物的迁移时间RSD<2.5%。随着进样针数的增加和进样时间的延长， 迁移时间RSD变大， 原因可能是样品在毛细管内壁的吸附或涂层有损坏。因此测定样品过程中， 需要用標准混合溶液进行重复性检测， 如标准样品的迁移时间出现较大偏差， 则需对毛细管进行冲洗；冲洗后无改善则需重新涂层处理， 以确保溶质迁移时间的重复性。从表4可见， 各被测物保留时间与保留因子测定的重复性均良好。但为了保证保留因子测定的准确性， 每个样品溶液中都加入DMSO和十二烷基苯， 以尽量减少迁移时间变化带来的保留因子测定误差。

3.4 不同微乳体系下的LSER方程

收集26个不同结构的小分子中性化合物， 以表2中的微乳体系作为分离介质， 测定溶质的保留因子， 用SPSS 19.0进行保留因子与溶质描述符间的多元线性回归， 建立LSER方程， 结果见表5。

总体上看， 实验中得出的各个微乳电动色谱体系的LSER方程系数都比较接近， 其中v和b的系数绝对值较大， 表明溶质的体积和氢键碱性对溶质保留贡献较大。 v绝对值较大表明体系中油滴形成腔穴对溶质保留所需能量低于水相； b值为负值表明微乳氢键碱性小于缓冲液， 随着溶质氢键碱性的增加将不利于溶质进入假固定相中。 a值在各体系LSER方程中大部分为负值且接近于0， 表明溶剂氢键受体能力在油水两相间的性能相似； s和 e的绝对值较小， 表明在溶质保留机制中偶极/极化率和溶质分子与溶剂的π或n电子的作用较弱[7，17]。

微乳相对于胶束溶液来说， 主要不同在于加入了助表面活性剂和油相[18]， 本研究系统比较了不同油相种类和含量对体系特征的影响。从表5中ME1～ME3， ME4～ME6体系的LSER方程可见， 在其它组成不变的情况下， 庚烷从0到1.0%， 辛醇从0到1.5%， LSER系数没有明显变化。 从ME2， ME5， ME7的方程系数可见， 不同油相种类（庚烷、辛醇、IPM）对体系特征也无影响。这些结果表明油相对MEEKC测定中性化合物的分离选择性没有明显影响。若待测化合物有一定的解离性， 则其分离选择性可能与油相有关[2]。助表面活性剂一般为短链醇， 它的加入可以改变微乳液滴的表面电荷密度和微乳结构的刚性， 有利于溶质的溶解和洗脱[10]。

表面活性剂的种类直接影响微乳的表面特性。SDS是MEEKC系统常用的表面活性剂， 本实验对以大豆磷脂和碳氟表面活性剂作为表面活性剂的新型微乳体系的溶剂化特征进行了研究（ME1， ME4， ME8， ME17）。结果表明， 大豆磷脂的加入， 没有改变微乳体系的基本特征。而据文献[19，20]报道， 在碳氟表面活性剂构成的胶束溶液中， 因碳原子上的所有氢原子被氟原子取代， 在溶质分配行为中氢键酸度作用贡献增加， 甚至强于氢键碱度， 与SDS胶束体系中氢键酸度贡献很小的结果显著不同。但本研究未得到一致结果， 在PFOSK或PFOSNH4形成的微乳体系中， 依然是氢键碱度的作用突出。这可能是因为本研究PFOSK或PFOSNH4体系中加入了SDS、SDC和丁醇等， 而SDS和SDC的氢键碱度作用贡献较大。

此外， 本实验还发现， 阳离子型表面活性剂CTAB建立的MEEKC体系的LSER方程系数与阴离子型表面活性剂构成MEEKC体系（ME1ME9）相比也无较大差异， 表明微乳液滴只是作为一个相对于水相极性较弱的假固定相， 其表面电荷性质不影响中性化合物的分离选择性。

3.5 与文献报道的其它色谱系统的比较

其它应用LSER模型研究溶质保留机制的色谱系统有磷脂膜色谱、胶束、微乳电动色谱系统等[21～27]， 本研究应用Lázaro 等提出的矢量距离法[28]比较了所建新型MEEKC系统与其它色谱系统间的接近程度。距离参数d的计算方法如下方程：

其中， p代表v， s， e， b， a中的任一系数， u代表标准化， i和j指待比较的两系统。本研究建立的体系与文献[13～19]报道的常见系统的比较见表6。

根据文献[6，29]报道， 系统间的距离d<0.25， 表明两系统特征较相似。从表6可见， 所建立的各种微乳体系彼此间距离d<0.1， 说明彼此间特征相近。所建微乳体系与正辛醇/水分配系数（lgP）、MEEKCSDS和磷脂膜色谱（pH 7.4）系统间的d值均约为0.25， 表明MEEKC、磷脂膜色谱与正辛醇水系统所测得的亲脂性参数一致， 表明MEEKC是预测lgP值的实用工具[7]。本研究中所用的磷脂微乳体系与其它MEEKC体系相比， 基线稳定性更好， 分离能力更强。

4 结 论

对于本研究测定的中性化合物， 无论是在大豆磷脂、SDS、CTAB， 还是碳氟类表面活性剂制备的微乳电动色谱中， 所得保留因子的LSER方程的基本特征相似， 都是v和b较大， 即溶质的体积和氢键碱度对其在微乳中的保留影响较大， 前者利于保留， 后者减弱保留。各体系之间距离也非常接近， 说明表面活性剂类型和油相组成对中性溶质在微乳体系中的保留选择性均无明显影响。若不考虑油相对微乳液滴刚性结构的影响， 微乳体系或许可以称为助表面活性剂修饰的胶束体系。

References

1 Chang C W， Chen Y C， Liu C Y. Electrophoresis， 2015， 36（21）： 2745-2753

2 Xiao W， Zhang Q， Chen C， Zhang Q H， Hu Y J， Xia Z N， Yang F Q. J. Pharm. Sci， 2016， 54（9）： 1678-1686

3 Buchberger W. Method Mol. Biol.， 2016， 1483： 91-109

4 Lucangioli S E， Kenndler E， Carlucci A， Tripodi V P， Scioscia S L， Carducci C N. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2003， 33（5）： 871-878

5 Lucangioli S E， Carducci C N， Scioscia S L， Carlucci A， Bregni C， Kenndler E. Electrophoresis， 2003， 24（6）： 984-991

6 Li L X， Yang J R， Huang H Z， Xu L Y， Gao C K， Li N. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（7）： 996-1006

7 Subirats X， Yuan H P， Chaves V， Marzal N， Rosés M. Electrophoresis， 2016， 37（14）： 2010-2016

8 Janicka M. J. Chromatogr. Sci.， 2014， 52（7）： 676-684

9 Baynes R E， Xia X R， Vijay V， Vijay J E. SAR QSAR Environ. Res.， 2008， 19（78）： 615-630

10 Stepnik K E， Malinowska I. J. Chromatogr. A， 2013， 1286： 127-136

11 Liu J F， Sun J， Sui X F， Wang Y J， Hou Y N， He Z G. J. Chromatogr. A， 2008， 11981199： 164-172

12 Vitha M， Carr P W. J. Chromatogr. A， 2006 1126（12）： 143-194

13 Jiang Z J， Reilly J， Everatt B， Briard E. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2011， 54（4）： 722-729

14 Lesellier. E. J. Chromatogr. A， 2015， 1389： 49-64

15 Liu J F， Sun J， Wang Y J， Li H Y， Sui X F， Li Y， He Z G. Asian J. Pharmaceut. Sci.， 2008， 3（4）： 158-167

16 Katayama H， Ishihama Y， Asakawa N. Anal. Chem.， 1998， 70（11）： 2254-2260

17 LI Jie， SUN Jin， HE ZhongGui. Acta Pharmaceutica Sinica， 2007， 42（1）： 13-18

李 潔， 孙 进， 何仲贵. 药学学报， 2007， 42（1）： 13-18

18 LIU JianFang， SUI XiaoFan， SUN Jin， WANG Yongjun， HE ZhongGui. J. Anal. Chem.， 2008， 36（12）： 1742-1748

劉建芳， 隋晓璠， 孙 进， 王永军， 何仲贵. 分析化学， 2008， 36（12）： 1742-1748

19 Esaka Y， Rin F， Kobayashi M， Osako R， Murakami H， Uno B. J. Chromatogr. A， 2014， 1385（2）： 261-268

20 Fuguet E， Ràfols C， Bosch E， Rosés M， Abraham M H. J. Chromatogr. A， 2001， 907（12）： 257-265

21 Abraham M H， Chadha H S， Whiting G S，Mitchell R C. J. Pharm. Sci.， 1994， 83（8）： 1085-1100

22 Li J， Sun J， Cui S M， He Z G. J. Chromatogr. A， 2006， 1132（12）： 174-182

23 Valko K， Du C M， Bevan C D， Reynolds D P， Abraham M H. J. Pharm. Sci.， 2000， 89（8）： 1085-1096

24 Trone M D， Khaledi M G. Anal. Chem.， 1999， 71（7）： 1270-1277

25 Abraham M H， Treiner C， Rosés M，Rafols C， Ishihama Y. J. Chromatogr. A， 1996， 752（12）： 243-249

26 García M A， Vitha M F， Sandquist J， Mulville K， Marina M L. J. Chromatogr. A， 2001， 918（1）： 1-11

27 García M A， Vitha M F， Marina M L. J. Liq. Chrom. Rel. Technol.， 2000， 23（6）： 873-895

28 Lázaro E， Ràfols C， Abraham M H， Rosés M. J. Med. Chem.， 2006， 49（16）： 4861-4870

29 Poole S K， Poole C F. J. Chromatogr. A， 2008， 1182（1）： 1-24