河内白曲霉酸性α－淀粉酶高产菌株的诱变选育*

张玉然 张晓云 郭兰英 张海林

（1济宁医学院生物科学学院 山东日照 276826 2山东徐旭酒曲有限公司 山东济宁 272000）

酸性α－淀粉酶属于液化酶（α－淀粉酶）的一种，可在低pH值条件下随机切断淀粉分子内的α－1，4糖苷键，迅速将其降解为糊精、寡糖等小分子［1－2］。 酸性 α－淀粉酶广泛应用于酿酒、制糖、纺织、饲料、造纸等行业，具有良好的社会和经济效益［3］。

在淀粉质原料的水解制糖工艺中，由于α－淀粉酶和糖化酶最适反应pH值的差异，淀粉质原料液化后进入糖化前需加入大量酸试剂调低pH值。开发耐酸性的α－淀粉酶，使其最适反应pH值与糖化酶相近，可节省大量酸试剂的消耗，节约成本［4－5］。

目前，研究者对黑曲霉和枯草芽孢杆菌液态发酵生产酸性α－淀粉酶的研究较多，并通过多种方法选育获得了高产菌株，广泛应用于医药、纺织和环境治理等领域［6－8］。 但在酿酒行业，由于白酒香味和口感的特殊需求，常利用河内白曲霉（Hanoiwhite starter）固态发酵生产酸性α－淀粉酶，并将生产出的含酸性α－淀粉酶的固态白曲直接应用于白酒生产。目前研究者对该菌株的研究较少，固态发酵的酸性α－淀粉酶酶活力普遍较低，筛选具有高产酸性α－淀粉酶能力的河内白曲霉势在必行。

本研究以河内白曲霉为出发菌株，采用不同浓度的DES诱变处理萌发过夜的河内白曲霉孢子，后根据透明圈法筛选高产突变株，进一步摇瓶复筛，以期获得产量高、稳定性好的河内白曲霉突变株。

1 材料与方法

1.1 材料

1）菌种。河内白曲霉为实验室保存。

2）培养基。

①改良的PDA培养基：土豆浸出汁 30%，琼脂 2%，自然pH值。②筛选培养基：玉米淀粉2%，酵母 0.5%，KCl 0.1%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.0002%，琼脂 2%，pH 6.5～7.0。③固体发酵培养基：麸皮12.5 g，自来水12.5 mL，置于500 mL三角烧瓶。

1.2 菌株的诱变筛选

1.2.1 孢子悬液的制备 于麦芽汁斜面培养基中刮取孢子，加入含25 mL 2 g/L葡萄糖的三角瓶中，混匀打散，稀释至孢子数为107CFU/mL，于室温下静置萌发过夜。

1.2.2 DES诱变及初筛 取5 mL过夜萌发的孢子悬液，分别加入DES至终浓度为0%、1%、3%、5%、6%、7%、9%、12%，混匀，30℃，220 r/min 振荡处理20 min后，各组分别加入等体积的25%Na2S2O3溶液终止反应。将诱变处理后的孢子悬液适当稀释，涂布于筛选培养基，35℃培养3～4 d，以未经诱变处理的出发菌株为对照，计算致死率。挑选长势良好、透明圈与菌落直径比值（HC）较大的单菌落进行复筛。

1.2.3 摇瓶复筛 挑取2环孢子，接种于固体发酵培养基，35℃培养，分别于第 24 h、36 h、48 h各翻曲一次，测定不同突变株酸性α－淀粉酶的酶活力。

1.2.4 传代培养 将诱变筛选出的突变株连续传代培养，测定各批次酸性α－淀粉酶酶活力。

1.3 酶活力测定 方法参照相关参考文献［9］进行。

2 结果与分析

2.1 不同浓度DES的致死率 诱变育种是获得高产菌株的常用方法［10－11］，将诱变致死率控制在75%～85%时诱变效果较佳，易获得高产突变菌。利用不同浓度DES处理河内白曲霉孢子20 min后的致死率曲线如图1所示。由图1可知，使用1%DES诱变处理20 min时，对河内白曲霉的致死率为84.3%。

图1 不同浓度DES诱变河内白曲霉的致死率

2.2 高产酸性α－淀粉酶突变株的初筛 将1%DES诱变处理20 min的河内白曲霉孢子悬液适当稀释涂布，培养观察并计算HC比值。从502株突变株中挑选出HC比值较高的突变株列于表1，可知突变株Hanoi white starter 4的HC比值最大，且长势良好。

表1 酸性α-淀粉酶高产突变株的初筛

2.3 高产酸性α－淀粉酶突变株的摇瓶复筛 对表1中初筛获得的突变株进行摇瓶复筛，各突变株发酵产酸性α－淀粉酶的能力如表2所示。可知，Hanoiwhite starter 4发酵酶活力最高，达20.8 U/g，较出发菌株提高了61.2%，这也与其HC比值最高相对应。

表2 高产酸性α-淀粉酶突变株的复筛

2.4 突变株Hanoi white starter 4的遗传稳定性将高产酸性α－淀粉酶的突变株Hanoi white starter 4于麸皮固体发酵培养基中连续传代培养6次，测定每批次的酸性α－淀粉酶酶活力，结果如图2所示。可知，该菌株产酸性α－淀粉酶的遗传稳定性良好，可用于后续工业放大生产。

图2 高产酸性α-淀粉酶突变株的遗传稳定性

3 结论

在酿酒行业，鉴于酒品质的高要求，该行业常使用河内白曲霉固态发酵生产酸性α－淀粉酶，为使淀粉质原料水解制糖工艺中α－淀粉酶和糖化酶最适反应pH值相近，节省大量酸试剂的消耗，节约成本，筛选耐酸性的α－淀粉酶十分必要。本研究以河内白曲霉为出发菌株，采用不同浓度DES诱变处理萌发的河内白曲霉孢子，根据透明圈大小初筛、摇瓶复筛高产酸性α－淀粉酶的突变株。研究结果表明，将萌发的孢子于1%DES处理20 min后，对河内白曲霉的致死率为84.3%，后经涂布筛选获得一株高产酸性α－淀粉酶的突变株Hanoi white starter 4，发酵后酶活力达20.8 U/g，较出发菌株提高61.2%。该突变株产酸性α－淀粉酶的遗传稳定性良好，可用于后续工业放大生产。

［1]王建玲，陈志鑫，刘逸寒，等.产耐酸性α－淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化.生物技术通报，2014，30(4)：159.

［2]Sharma A，Satyanarayana T.Microbial acid－stable α－amylases：characteristics，genetic engineering and applications.Process Biochemistry，2013，48(2)：201.

［3]Kalpana B J，Pandian S K.Halotolerant，acid－alkali stable，chelator resistant and raw starch digesting α－amylase from a marine bacterium Bacillus subtilis S8－18.Journal of Basic Microbiology，2014，54(8)：802.

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［6]钱萍.酸性淀粉酶菌株的诱变选育及酶学性质研究.食品工业 科 技，2012，33(11)：184.

［7]王发祥，俞健，王建辉，等.1株产酸性α－淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化.食品科学，2014，35(1)：156.

［8]Sharma A，Satyanarayana T.Production of acid－stable and high－maltose－forming α－amylase of Bacillus acidicola by solid－state fermentation and immobilized cells and its applicability in baking.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168(5)：1029.

［9]贺胜英，杨云娟，许波，等.白曲霉Asp－amy1固体发酵生产酸性淀粉酶的初步研究.酿酒科技，2009(8)：42.

［10]田丰伟，程传荣，袁维涵，等.原生质体诱变选育ε－聚赖氨酸高产菌株.微生物学通报，2010，37(10)：1457.

［11]刘俊梅，王庆，王丹，等.紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育PHB 高产菌株.微生物学通报，2016，43(10)：2242.