四川12株野生灵芝遗传多样性的ISSR分析

陈小敏,陈 勇,吴海冰,辜运富

(1.四川农业大学资源学院，成都 温江 611130)

四川12株野生灵芝遗传多样性的ISSR分析

陈小敏,陈 勇,吴海冰,辜运富*

(1.四川农业大学资源学院，成都 温江 611130)

目前灵芝生产菌种品性退化，故野生灵芝资源的筛选评价对于选育优质新品种具有重要意义。本研究从四川采集12株野生灵芝，采用苯酚-硫酸法、香草醛-高氯酸显色法测定了子实体多糖和总三萜含量，并进一步采用ISSR(inter-simple sequence repeat)和ITS(internal transcribed spacer)分子技术分析它们的遗传多样性和系统发育特征。表明：SICAU-12子实体多糖含量、SICAU-5子实体总三萜含量明显高于其它菌株子实体。ISSR聚类分析显示出供试菌株的总体相似性为0.52，相似系数为0.54时聚为两大类群；系统发育树将供试野生灵芝分为赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinense)两大类群。四川收集的野生灵芝菌株具有较为明显的遗传多样性；SICAU-12多糖含量高、SICAU-5总三萜含量高，具有潜在应用价值。

四川野生灵芝；多糖；总三萜；遗传多样性

灵芝隶属于真菌界(Kingdom Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，担子菌纲(Basidiomycetes)，灵芝目(Ganodermatales)，灵芝科(Ganodermataceae)，有“仙草”、“瑞草”等称呼，主要活性成分为多糖、三萜化合物等，具有抗癌、抗肿瘤、保肝解毒等方面的作用[1-3]。目前，人工栽培灵芝规模逐渐扩大，生产栽培方式呈多样化，但是栽培效益每况愈下。由于长期引种和环境因素的影响，导致灵芝菌种品性退化、名称混杂[4]。菌种是灵芝产量低下、品质难于控制的关键问题[5]，灵芝产业的持续健康发展依赖于优质灵芝新品种的选育。野生灵芝作为杂交育种的基础材料，挖掘野生资源并对其进行基础研究具有十分重要的意义。野生灵芝的形态特征易受到野外环境的胁迫，形成了多样化的表型特征，仅靠形态学特征难以真正鉴定灵芝菌种[6-7]，所以科学准确地鉴定野生灵芝菌株的遗传特性显得尤为重要。随着分子生物学的不断发展，人们开始从分子遗传水平上认识物种的遗传特性，目前ITS和ISSR这两种分子技术已广泛用于探讨真菌种内变异和属内种间的亲缘关系。真核生物rDNA的ITS区段保守性强且具有特异性[8-10]，张肖雅[11]等人采用ITS分子技术对11株灵芝菌株进行了鉴定分析。ISSR[12]分子标记技术稳定、简便、多态性丰富，在研究菌株遗传多样性上具有优越性，被广泛用于大型食用真菌的遗传多样性研究[13]。四川气候类型多变，拥有丰富的林木资源，灵芝资源丰富。本文利用ISSR分子标记、ITS测序技术对12株四川野生灵芝进行遗传多样性分析，并结合子实体多糖和总三萜含量等指标来综合评价收集到的野生灵芝的多样性及应用价值，以期为丰富灵芝资源库，选育高活性成分的优质灵芝新品种及科学管理灵芝菌种提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试野生菌株12株，采自四川攀枝花市、峨眉山市、乐山市等地(见表1)。

1.2 灵芝子实体多糖测定

标准曲线的制备[14]：无水葡萄糖60℃烘干至恒重，精确称取0.10g，加水定容至100mL。分别吸取0、20、60、100、160、200、300μL葡萄糖标准溶液，水补足至2mL，各加入1mL5%的苯酚溶液和5mL浓硫酸，室温下反应30min，490nm处比色测定其吸光度。将采集到的成熟子实体60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛。精确称取0.50g，加50mL超纯水，沸水回流2h后过滤。取滤液加入无水乙醇至终浓度为75%，低温醇沉过夜，Sevage试剂(氯仿/正丁醇5∶1)去蛋白。吸取上清液，各加入1mL 5%的苯酚溶液和5mL浓硫酸，室温下反应30min，490nm处测定吸光度。

表1 供试菌株

1.3 灵芝子实体总三萜测定

标准曲线的制备[14]：准确称取10mg齐墩果酸标准品，氯仿溶解定容至100mL。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液，100℃水浴蒸干溶剂，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混匀，60℃水浴20min，冰水浴冷却，加5mL冰醋酸，混匀后548nm处测吸光度。精密称取子实体样品2g于100mL容量瓶中，加入氯仿超声30min后过滤。吸取滤液1mL，100℃水浴蒸干溶剂，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混匀，60℃水浴20min，冰水浴冷却，加5mL冰醋酸，混匀后548nm处测吸光度。

1.4 菌种分离

用75%乙醇对野生灵芝表面进行消毒，无菌环境下取黄豆大小菌肉于PDA斜面培养基中，25℃避光培养5～8d，菌种纯化后即得野生灵芝菌株。

1.5 DNA的提取及ISSR扩增

挑取斜面培养基表面生长旺盛的菌丝，液氮研磨，按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工Sangon Biotech)给定的步骤进行操作，提取出的DNA于-20℃保存备用。在前期的试验中，选用引物P1-P49进行ISSR扩增，结果表明引物P8(5'-GGAGGAGGAGGAGGA-3')扩增效果最佳，谱带稳定、清晰、多态性丰富。反应体系为20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL (TIANGEN)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)、引物P8 2μL(10μmol.L-1)，ddH2O补齐至20μL。扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性1min，52℃复性1min，65℃延伸8min，30个循环；65℃最终延伸16min；4℃终止反应。取PCR产物8μL在含EB的2%琼脂糖凝胶上水平电泳检测，80V/cm电泳90min，以DNA MarkerDL2000作为分子量标准，自动凝胶成像系统拍照检测。根据ISSR扩增出的谱带图，将同一位置条带出现与否记为1、0，构建数字化矩阵，用软件NTSYSpc2.1进行遗传聚类分析[15]。

1.6 ITS测序

用通用引物ITS1和ITS4对12个灵芝菌株ITS序列进行扩增[16]。反应体系为50μL：2×Taq PCR Master Mix25μL(TIANGEN)、引物ITS1/ITS4各0.5μL(10μmol.L-1)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)，加ddH2O补齐至50μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环；72℃最终延伸1min；10℃终止反应。取PCR产物3μL在含EB的1%琼脂糖凝胶上水平电泳检测，120V/cm电泳20min，以DNA MarkerDL2000作为分子量标准，自动凝胶成像系统拍照检测。将其产物交由擎科生物技术有限公司(成都)完成测序，向NCBI提交供试菌株的ITS序列，获得序列号：KX262896-KX262907。

1.7 数据处理

用Excel 2003进行数据基础处理，数据的统计分析由SPSS 20完成。利用NTSYSpc2.1构建基于ISSR分析的聚类图谱，利用MEGA5的Neighbor-Joining tree程序构建基于ITS序列的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 灵芝子实体多糖和总三萜含量

供试灵芝子实体多糖和总三萜含量如表2所示。由表2可知，SICAU-12子实体的多糖含量显著高于其他灵芝菌株子实体，为1.37%，SICAU-8子实体多糖含量最低，为0.72%，SICAU-7、SICAU-12两个菌株的子实体多糖含量显著高于其它菌株。由表2可以看出，不同灵芝子实体总三萜含量有着明显的差异，SICAU-5含量最高，为1.37%，SICAU-4的含量最低，仅为0.43%。

表2 不同灵芝菌株子实体多糖、总三萜含量

注：小写字母a-i表示95%置信度的显著性差异

2.2 ISSR聚类分析

ISSR-PCR扩增出的条带大小在2000bp～100bp之间，聚类图谱如图1所示。由图1可知，供试的12个灵芝菌株总体相似性为0.52，具有明显的遗传多样性。遗传相似系数小于0.52时，所有的菌株都聚为一类；在0.54的相似系数水平上，供试菌株聚为2大类群，SICAU-1、SICAU-4、SICAU-5、SICAU-6、SICAU-7和SICAU-10 等6个菌株聚为一类，其余6个菌株聚为一类。SICAU-1和SICAU-10的遗传相似系数高达0.96，两者的遗传关系最近；SICAU-6和SICAU-9的遗传关系最远。

图1 供试灵芝菌株的ISSR聚类分析

2.3 系统发育树

将测序得到的12个灵芝菌株ITS序列在NCBI数据库中比对，选择匹配度最高的参比菌株(如图2所示)，对12个供试菌株和6个GenBank参比序列构建系统发育树。

图2 供试菌株系统发育树，加粗为供试菌株

由图2可知，与供试灵芝菌株相似性高的为Ganoderma Lucidum(赤芝)和Ganoderma Sinense(紫芝)。供试12个野生灵芝菌株在系统发育树主要分为两个大支，菌株SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11、SICAU-12与赤芝(Ganoderma lucidum，GU213476、GU213478、EF188277)聚在一个大群中。菌株SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9等5个菌株与紫芝(Ganoderma sinense，HQ235633、DQ424982、DQ425014)聚在第二个群中。

3 讨论

本试验测定了四川不同地区采集的12株野生灵芝子实体多糖和总三萜含量，灵芝多糖和三萜类化合物是灵芝主要的活性物质，起着关键药效作用[17-18]。供试灵芝菌株子实体多糖含量在0.72%～1.37%范围之间，总三萜含量在0.43%～1.37%之间，采集的四川地区野生灵芝子实体的多糖和总三萜含量有着明显的差异性，SICAU-12子实体多糖含量、SICAU-5总三萜含量最高。付立忠等人分析与评价12 个灵芝品种的子实体多糖和三萜含量，多糖含量为0.75%～1.16%，三萜含量为0.41%～1.19%[14]。对比前人研究结果，菌株SICAU～7、SICAU-12子实体多糖含量及SICAU-5三萜含量更高，说明这3株野生灵芝在药效方面上更具潜在的应用价值。

灵芝的生长易受到野外环境的影响，造成灵芝形态特征的多样性，因此传统的形态学分类法不能有效区分野生灵芝菌株。分子生物学的发展，推动了分子标记法在菌株鉴定上的应用。ISSR分子标记技术自1994年由Ziekiewicz提出以来，广泛用于食用菌遗传多样性[19-20]和菌株的鉴定鉴别[21-22]。不同的灵芝菌株的DNA序列存在差异，在ISSR-PCR扩增时DNA序列与引物结合，不同菌株就会出现独特的ISSR条带，因此，ISSR分子标记技术能反应出供试菌株间的遗传多样性。在本试验中，供试野生灵芝菌株的ISSR电泳图谱具有明显的差异性，聚类分析显示出相似系数小于0.52时，供试菌株聚为一类，相似系数为0.54时，聚类两大类群，说明供试12株灵芝菌株间表现出明显的遗传多样性。

近年来，研究人员采用DNA序列分析研究微生物的系统发育学，食用菌的DNA序列研究集中在rDNA上，基于ITS序列构建系统发育树是目前研究食用菌种间、种内水平差异的主要分子手段[23-24]。本研究中基于ITS序列构建的系统发育树将供试菌株分为赤芝和紫芝两大类群，这与相似系数为0.54的ISSR聚类分析结果相似。SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11和SICAU-12与赤芝聚在一个大群中；SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9与紫芝聚在另一个大群中。

综上所述，本研究运用ISSR分子标记和ITS测序对四川不同地区收集到的12株野生灵芝菌株进行遗传多样性和系统发育分析，同时测定了这些野生资源的多糖和三萜化合物含量。结果表明，供试四川野生灵芝菌株具有明显的遗传多样性；SICAU-12多糖含量、SICAU-5总三萜含量高，且二者的遗传关系远，可作为潜在高活性物质的灵芝新品种杂交亲本。

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2017-03-18

四川省“十三五”育种攻关项目资助(2016NYZ0040)

陈小敏(1992- )，女，四川什邡人，硕士研究生，研究方向为食用菌品种选育。*为通讯作者。