Kv7通道对人胎盘绒毛膜板动脉血管环舒缩功能的影响及其机制

魏晓红，傅晓冬

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

Kv7通道对人胎盘绒毛膜板动脉血管环舒缩功能的影响及其机制

魏晓红，傅晓冬

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的 探讨Kv7通道对人胎盘绒毛膜板动脉(CPAs)血管环舒缩功能的影响及其可能的机制。方法 取内皮完整或去内皮CPAs血管环，分别加入累积浓度递增的XE991、Linopirdine或二甲基亚砜(DMSO)，计算收缩率。取去内皮CPAs血管环，经过或者不经过XE991孵育后加入累积浓度递增的U46619，计算收缩率。将去内皮CPAs血管环加入1×10-7mol/L U46619进行预收缩处理，分别加入累积浓度递增的Kv7通道开放剂[Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352、ML277]及DMSO，计算舒张率。取去内皮CPAs血管环，分别经硝苯地平、levcromakalim及无钙液处理后加入XE991(1×10-5mol/L)或Linopirdine(1×10-4mol/L)，计算处理前后收缩率。结果 内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环收缩率随着XE991、Linopirdine浓度的升高而升高，分别于5×10-5、1×10-4mol/L时收缩率最大。与加入同浓度DMSO作用后比较，内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环加入XE991或Linopirdine作用后的收缩率均升高(P均<0.01)。内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环加入同浓度XE991或Linopirdine作用后的收缩率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。随着U46619浓度的升高，经过或者不经过XE991孵育的去内皮CPAs血管环收缩率均逐渐升高，但经过孵育后升高更明显(P均<0.01)。U46619预收缩CPAs血管环加入1×10-4mol/L Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352作用后的舒张率均高于加入同浓度DMSO(P均<0.01)，加入ML277作用后的舒张率无明显变化(P均>0.05)。XE991组和Linopirdine组经硝苯地平、levcromakalim及无钙台式液处理后的收缩率均低于处理前(P均<0.01)。结论 Kv7通道通过介导细胞膜静息K+电导和静息膜电位的改变而参与调节CPAs血管环的舒缩；阻断Kv7通道可引起CPAs平滑肌细胞去极化，激活L型钙离子通道，引起Ca2+内流和血管收缩。

人胎盘绒毛膜板动脉；Kv7通道；血管平滑肌；血管张力

胎盘绒毛膜板动脉(CPAs)具有小阻力动脉的特点，是将胎儿体内的去氧血液通过脐动脉运往绒毛毛细血管、与绒毛间隙内的母体血进行物质交换的枢纽，该血管张力调节异常将引起胎儿生长发育迟缓、胎儿宫内窘迫、新生儿窒息等[1,2]。Kv7通道是电压门控性钾通道家族亚型，由KCNQ基因编码，主要与细胞膜电位的超极化有关，迄今为止共发现了5个Kv7通道家族成员：Kv7.1～Kv7.5(KCNQ1～KCNQ5)[3]。Kv7通道蛋白在人CPAs平滑肌及分离的细胞中均有表达，非特异性Kv7阻断剂Linopirdine能收缩血管，非特异性Kv7开放剂Retigabine能舒张血管[4]。目前关于Kv7通道在胎儿血管舒缩活动中的作用及其机制国内报道较少。为此，我们于2016年3～4月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 主要药品与试剂：血栓素A2类似物U46619，Kv7通道开放剂Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352、ML277、硝苯地平、levcromakalim均购自美国Sigma公司；乙酰胆碱(ACh)、EGTA及其余配液所用的药品均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；U46619、chromanol 293B、Retigabine、Acrylamide(S)-1、BMS-204352、硝苯地平、levcromakalim均溶于二甲基亚砜(DMSO)，ACh溶于双蒸水；台氏液(pH=7.4)：NaCl 127 mmol/L，KCI 5.9 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 12 mmol/L。主要仪器：DMT610M小血管张力测定仪(丹麦DMT公司)，XTB-01型体视显微镜(德国Leica公司)，四腔离体血管浴槽(ML0146，西班牙Panlab公司)。

1.2 CPAs血管环制备 选取同期于西南医科大学附属医院产科终止妊娠的健康产妇35例(顺产或者剖宫产)，年龄(30.65±7.85)岁，收缩压(121.57±4.35)mmHg、舒张压(76.33±7.85)mmHg，孕周36～40周。排除合并妊娠并发症者及有吸烟史者。待产妇胎盘娩出后，立即取含CPAs的胎盘组织块约2 cm×2 cm×2 cm，置于4 ℃台氏液中转入实验室。在体视显微镜下钝性分离CPAs的二级或三级分支，剔除血管周围组织，将动脉剪成长度为2～3 mm的血管环。将动脉环段套在DMT恒温浴槽的金属丝上，浴槽温度保持在37 ℃，并加入台式液，持续通入混合气体(含95% O2和5% CO2)。浴槽的一端连接微调装置(调节负荷张力)，另一端通过张力换能器与Powlab系统相连，记录血管收缩与舒张曲线。调节实验最适初始张力，每隔30 min更换1次台式液。血管稳定1 h后，用含80 mmol/L K+的高钾台式液(等摩尔浓度的KCl替代NaCl使K+浓度增加到80 mmol/L)检测CPAs血管环的收缩性，两次收缩幅度差<10%证实CPAs血管环制备成功。将CPAs血管环分为两部分，一部分通过金属丝反复摩擦血管环内侧去除血管内皮，加入1×10-5mol/L ACh后检测血管舒张度<20%，为内皮完整去除的CPAs血管环(下称去内皮CPAs血管环)。另一部分不予处理，检测血管舒张度>80%，为内皮完整的CPAs血管环(下称内皮完整CPAs血管环)[8]。

1.3 Kv7通道对CPAs血管环舒缩功能影响的观察

1.3.1 Kv7通道非特异性阻断剂对CPAs血管环收缩功能的影响 取30条内皮完整CPAs血管环随机分为三份各10条，分别在血管环稳定后累积加入Kv7通道非特异性阻断剂XE991、Linopirdine或DMSO，使其在浴槽中的终浓度分别依次递增至1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、5×10-5、1×10-4mol/L，每次加药后待血管环张力达到坪值，再加下一个浓度。取30条去内皮CPAs血管环，参照上法处理。检测CPAs血管环的收缩幅度，以该血管的收缩幅度占同一根血管经80 mmol/L KCl引起收缩幅度的百分比计算收缩率。

1.3.2 血栓素A2类似物U46619对CPAs血管环收缩的影响 将40条去内皮CPAs血管环分为XE991+U46619组、U46619组各15条，对照组10条。XE991+U46619组先加入1×10-5mol/L XE991孵育20 min，再累积加入U46619使其在浴槽中的终浓度依次递增至1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L。U46619组、对照组采用同样的方法累积加入U46619或DMSO，不行XE991孵育。检测三组CPAs血管环的收缩幅度，参照1.3.1的方法计算收缩率。

1.3.3 Kv7通道开放剂对U46619预收缩CPAs血管环舒张功能的影响 取50条去内皮CPAs血管环分为5组，预先加入1×10-7mol/L U46619进行预收缩，分别累积加入Kv7通道开放剂Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352、ML277及DMSO，使其在浴槽中的终浓度依次递增至1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L，以仅加入U46619预收缩的CPAs血管环作为空白对照。检测各组CPAs血管环的收缩幅度，计算舒张率。舒张率=(空白对照血管环收缩幅度-实验血管环收缩幅度)/空白对照血管环收缩幅度×100%。

1.4 硝苯地平、levcromakalim及无钙台式液对XE991和Linopirdine收缩血管作用影响的观察 将20条去内皮CPAs血管环分为XE991组、Linopirdine组各10条。XE991组采用含钙台式液冲洗，待血管稳定后分别加入1×10-5mol/L XE991。每隔10 min用无钙台氏液(无CaCl2，加入10 mmol/L EGTA)冲洗血管1次，共冲洗3次。待血管稳定30 min后，加入1×10-5mol/L XE991，参照1.3.1的方法计算无钙台氏液处理前后的收缩率。用含钙台式液冲洗血管环，待血管稳定30 min后加入硝苯地平 (1 μmol/L)或levcromakalim(10 μmol/L)孵育20 min，再加入1×10-5mol/L XE991，参照1.3.1的方法计算硝苯地平或levcromakalim处理前后的收缩率。Linopirdine组的实验步骤与XE991组相同，加入Linopirdine的浓度为1×10-4mol/L。

2 结果

2.1 不同浓度XE991、Linopirdine作用后CPAs血管环收缩率比较 随着XE991浓度的升高，内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环收缩率均先升高后降低，5×10-5mol/L时收缩率最大；随着Linopirdine浓度升高，内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环收缩率均逐渐升高，1×10-4mol/L时收缩率最大。与加入同浓度DMSO作用后比较，内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环加入XE991或Linopirdine作用后的收缩率均升高(P均<0.01)。内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环加入同浓度XE991作用后的收缩率比较、加入同浓度Linopirdine作用后的收缩率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 不同浓度XE991、Linopirdine作用后CPAs血管环的收缩率比较

注：与相同内皮情况的CPAs血管环加入DMSO后比较，*P<0.01。

2.2 XE991+U46619组、U46619组与对照组收缩率比较 随着U46619浓度的升高，XE991+U46619组、U46619组收缩率均逐渐升高。与对照组同浓度比较，XE991+U46619组、U46619组收缩率均升高，但XE991+U46619组升高更明显(P均<0.01)。见表2。

2.3 U46619预收缩CPAs血管环经Kv7通道开放剂及DMSO作用后的舒张率比较 U46619预收缩CPAs血管环加入Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352作用后的舒张率随着药物浓度的升高而升高。U46619预收缩CPAs血管环加入1×10-4mol/L Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352作用后的舒张率均高于加入同浓度DMSO作用后(P均<0.01)。U46619预收缩CPAs血管环加入ML277

表2 XE991+U46619组、U46619组与对照组收缩率比较

注：与对照组同浓度比较，*P<0.01；与U46619组同浓度比较，#P<0.01。

作用后的舒张率与加入同浓度DMSO作用后比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 U46619预收缩CPAs血管环经Kv7通道开放剂及DMSO作用后的舒张率比较

注：与同浓度DMSO比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 XE991组与Linopirdine组经硝苯地平、levcromakalim及无钙台式液处理前后收缩率比较 XE991组和Linopirdine组经硝苯地平、levcromakalim及无钙台式液处理后的收缩率均低于处理前(P均<0.01)。见表4。

表4 XE991组与Linopirdine组经硝苯地平、levcromakalim

注：与同组处理前比较，*P<0.01。

3 讨论

目前，新型Kv7钾离子通道开放剂(BMS-204352、S-1 acrylamide、chromanol 293B等)不断被发现[5～7]。Kv7通道属于电压依赖性钾离子通道家族，其编码基因KCNQ2、KCNQ3构成的多聚体是神经元M通道的分子基础，记录的电流称为M型电流，参与调节细胞膜电位、神经元兴奋性和动作电位发放频率等[9,10]。与M型电流特征相似，Kv7通道K+电流同样参与调节平滑肌细胞膜的静息电位，引起膜电位超极化，血管舒张。阻断Kv7通道K+电流可引起血管平滑肌细胞去极化，如果细胞膜去极化达到激活L型钙离子通道，则会引起Ca2+内流和血管收缩，间接支持Kv7通道参与调节细胞膜静息电位的潜能。Linopirdine和XE991是目前公认的Kv7通道非选择性阻断剂，已广泛用于治疗认知障碍和阿尔茨海默病[11，12]。对于不同细胞类型的Kv7通道，Linopirdine和XE991的阻断效能各不相同，取决于KCNQ通道亚基的组成，但在其阻断Kv7通道的有效浓度范围内，其阻断作用对其他类型的K+离子通道没有影响[11,13,14]。

Kv7通道阻滞剂通过刺激动脉壁神经末梢递质的释放而引起血管收缩，是其参与血管收缩反应的重要方式，但脐血管和胎盘血管都是没有神经支配的血管[15]，故神经递质释放并不参与Kv7通道阻滞剂介导的CPAs收缩反应。本研究结果显示，内皮完整CPAs血管环与去内皮CPAs血管环收缩率随着XE991、Linopirdine浓度的升高而升高，均分别于5×10-5、1×10-4mol/L时收缩率最大，但二者加入同浓度XE991或Linopirdine作用后的收缩率比较差异均无统计学意义。说明Kv7通道非特异性阻断剂XE991和Linopirdine均能显著引起CPAs血管环收缩，且与内皮是否完整无关；Kv7通道阻滞剂是直接作用在血管壁的平滑肌细胞而引起CPAs收缩。本研究显示，Linopirdine或XE991引起CPAs的收缩作用在无钙台式液中消失，表明该血管收缩依赖细胞外Ca2+流入平滑肌细胞内，并不涉及细胞内储存Ca2+的释放；此外, 钙通道阻滞剂硝苯地平处理后Linopirdine或XE991同样无法再引起血管收缩，提示Linopirdine或XE991引起的血管收缩反应是细胞外Ca2+通过L型电压门控钙离子通道进入细胞内诱发的，间接证明Kv7通道阻滞剂是通过阻断细胞静息状态下的K+通道，诱导平滑肌细胞膜去极化，激活L型钙离子通道，进而引起CPAs收缩。Levcromakalim是一类ATP依赖性钾通道开放剂，诱导通道开启后，超极化动脉平滑肌细胞电位接近K+平衡电位，本研究Levcromakalim处理后Linopirdine或XE991引起的CPAs收缩反应消失，进一步说明Kv7通道阻断剂引起血管收缩的机制与调节细胞膜静息电位、电压依赖性Ca2+内流引起血管平滑肌细胞去极化有关。

U46619作用于血栓素受体而收缩血管平滑肌。本研究发现，U46619能浓度依赖性收缩CPAs血管环，而Kv7通道阻滞剂XE991能增强U46619引起的血管收缩，且化学结构不相同的Kv7.2～Kv7.5开放剂[Acrylamide(S)-1、Retigabine、BMS-204352]对U46619预收缩血管均有明显的舒张作用，但Kv7.1特异性通道开放剂ML277对U46619预收缩血管环无明显舒张作用[16]。Tatulian等[17]研究显示，Retigabine能够激活Kv7.2～Kv7.5通道，微弱抑制Kv7.1通道，对Kv7通道家族选择性强弱顺序为Kv7.3>Kv7.2>Kv7.4。Dupuis等[18]研究发现，BMS204352同样开放Kv7.2～Kv7.5通道,选择性增大Kv7.5通道电流，但强烈抑制Kv7.1通道。Bentzen等[19]发现，Acrylamide(S)-1同样开放Kv7.2～Kv7.5通道,是一个比Retigabine更有效的松弛剂，优先选择影响Kv7.4通道。结合本实验结果分析，Kv7.4和Kv7.5通道在调节CPAs血管环舒缩过程中具有更重要的作用，Kv7.1并不参与CPAs血管环的张力调节；不管是静息状态还是预收缩状态，Kv7通道介导CPAs血管环的舒缩作用是一致的，与以往研究结论相同[20，21]。

综上所述，Kv7通道通过介导细胞膜静息K+电导和静息膜电位的改变而参与调节CPAs血管环的舒缩，与血管内皮完整性无关；阻断Kv7通道可引起CPAs平滑肌细胞去极化，激活L型钙离子通道，引起Ca2+内流和血管收缩。Acrylamide(S)-1等Kv7通道开放剂可以扩张CPAs，为胎儿生长受限、妊娠高血压等疾病的治疗提供新思路。

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Effects of Kv7 channels on vasomotor function of human placental chorionic arteries

WEIXiaohong,FUXiaodong

(TheAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To study the effects of Kv7 channels on the vasomotor function of human placental chorionic arteries (CPAs). Methods The vascular rings of CPAs with integrated or denuded endothelium were added with the cumulative concentrations of KCNQ channel blockers (XE991 and Linopirdine) or DMSO and we calculated the vasoconstriction. The endothelium-denuded vascular rings of CPAs were added with the cumulative concentrations of U46619 with or without the incubation of XE991, and we calculated the vasoconstriction. The endothelium-denuded vascular rings of CPAs were first treated with U46619 (10-7mol/L), and then were added with the cumulative concentrations of Kv7 channels openers [Acrylamide (S)-1, Retigabine, BMS-204352 and ML277] or DMSO, and we and we calculated the vasoconstriction. The endothelium-denuded vascular rings of CPAs were pretreated with nifedipine, levcromakalim and calcium-free liquid and then were added with XE991(10-5mol/L) or Linopirdine (10-5mol/L), at last, we calculated the vasoconstriction before and after treatment. Results The vasoconstrictions of vascular rings of CPAs with integrated or denuded endothelium increased with the increased concentrations of XE991 and Linopirdine (10-8-10-4mol/L), and the highest vasoconstrictions apperated at 5×10-5and 10-4mol/L, which were higher than those treated with the same concentrations of DMSO (allP<0.01). No significant difference was found in the vasoconstriction of vascular rings treated with the same concentration of XE991or Linopirdine between the vascular rings of CPAs with integrated endothelium and vascular rings of CPAs with denuded endothelium (allP>0.05). With the increased concentrations of U46619, the vasoconstriction of endothelium-denuded vascular rings of CPAs with or without the incubation of XE991 increased gradually, and the increase was more significant after the incubation (allP<0.01). Acrylamide (S)-1, Retigabine, and BMS-204352 (10-4mol/L) relaxed more the U46619-induced contraction of vascular rings of CPAs as compared with that of DMSO (allP<0.01), but ML277 had no effect on U46619-induced relaxation (allP>0.05). The vasoconstriction was lower after treatment of nifedipine, levcromakalim and calcium-free liquid as compared with that before treatment in the XE991 and Linopirdine groups (allP<0.01). Conclusion Kv7 channels (KCNQ) is involved in regulating CPAs tension by mediating the resting cell membrane K+conductance and static rate of membrane potential changes, and has nothing to do with endothelial integrity. Blocking KCNQ channels can cause the depolarization of vascular smooth muscle cells, activate the L-type calcium channel, and cause calcium ion flow and vasoconstriction.

human placental chorionic artery; Kv7 channel; placenta; vascular smooth muscle; vascular tone

四川省科学技术厅与泸州市人民政府、泸州医学院联合科研专项资金计划项目(川科发计[2014]10号)。

魏晓红(1991-)，女，硕士研究生在读，研究方向为围产医学。E-mail: wxh18283020645@163.com

傅晓冬(1964-)，女，主任医师，研究方向为围产医学。E-mail: dongerfu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.008

R331

A

1002-266X(2017)16-0028-05

2016-08-23)