氟对小鼠MC3T3-E成骨细胞内Ca2+，NO浓度的影响

邢艳刚，张丹丹，张文艳，周文丽，阎小艳，5

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院，山西太原030031；3.深圳大学生物科技学院，广东深圳518000；4.华南师范大学生物科技学院，广东广州510000；5.山西医科大学公共卫生系，山西太原030001）

氟对小鼠MC3T3-E成骨细胞内Ca2+，NO浓度的影响

邢艳刚1，张丹丹2，张文艳3，周文丽4，阎小艳1，5

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院，山西太原030031；3.深圳大学生物科技学院，广东深圳518000；4.华南师范大学生物科技学院，广东广州510000；5.山西医科大学公共卫生系，山西太原030001）

为了探究不同浓度的氟化钠对小鼠MC3T3-E成骨细胞内Ca2+，NO浓度以及细胞凋亡的影响，建立细胞梯度染氟模型，获取MTT细胞增殖曲线；通过DAPI和HE染色观察细胞核及细胞形态学变化；运用荧光探针Fluo-3 AM和DAF-FMDA标记染氟成骨细胞，采用流式细胞仪测定成骨细胞内Ca2+，NO浓度变化。结果表明，随着氟浓度的增加，细胞形态异常，细胞增殖率降低，成骨细胞内Ca2+，NO的浓度增加，高氟长时间作用会使细胞生命活性降低，生理反应减弱或缺失，从而影响Ca2+，NO的浓度。试验证明，高氟通过增加细胞内Ca2+，NO的浓度抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

氟；成骨细胞；Ca2+；NO

氟是机体维持正常新陈代谢不可缺少的微量元素之一，但如果长期摄入过量氟会使机体发生氟中毒。氟中毒是一种慢性全身性疾病，主要形成氟斑牙和氟骨症[1]。慢性氟中毒可引发骨硬化、骨软化、骨质疏松、软组织化骨以及软骨和关节等不同性质的病变[2-4]。氟对骨骼系统的损害作用已经得到广泛认可，但是关于高氟致成骨细胞凋亡机制仍不清楚。Ca2+和NO在引发细胞凋亡过程中具有重要的信号分子作用，国内外的一些文献对此都有论述，GAO等[5]、马轶杰等[6]、CHAO等[7]、ELROD等[8]、SHARP等[9]、LIU等[10]都已探讨过钙离子和NO对细胞的作用，但Ca2+和NO在氟致成骨细胞毒性中起什么作用及其机制尚不清楚。

本试验通过建立氟对成骨细胞作用的体外模型，运用MTT法测定氟对成骨细胞增殖的影响，通过HE和DAPI染色观察氟对成骨细胞形态，用荧光探针Fluo-3 AM和DAF-FM DA标记染氟成骨细胞的流式细胞术检测氟致小鼠成骨细胞内Ca2+和NO的浓度变化，以探究氟诱导的小鼠成骨细胞凋亡过程中Ca2+，NO的浓度变化。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞株MC3T3-E1 Subclone 14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14细胞株（中国科学院细胞库）。

1.1.2 主要溶液胎牛血清，DMEM培养基，0.5% MTT，无Ca2+和Mg2+的无菌PBS缓冲液，DAF-FM DA稀释液，Fluo-3 AM。

1.2 试验方法

1.2.1 氟对成骨细胞作用的体外模型的影响用含有10%胎牛血清培养基培养MC3T3-E1 Subclone 14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14细胞，置于5%CO2培养箱，每3 d换液一次。细胞密度大于95%时，用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，传代培养。待细胞贴壁后，进行后续测定。

1.2.2 氟对小鼠成骨细胞形态的影响细胞以1×105个/mL接种于24孔培养板，每孔1 mL。48 h后弃旧培养液，PBS洗涤，换不同质量浓度NaF（0，5，10，30 mg/L）处理，72 h后进行HE和DAPI染色。分别在相差显微镜和荧光显微镜下观察。

1.2.3 MTT法测成骨细胞增殖率贴壁细胞以1×105个/mL接种于96孔板，不同质量浓度NaF（0，1，5，10，30 mg/L）处理，隔天换液。分别于药物处理24，48，72，96 h后加入0.5%MTT，20 μL/孔，继续培养4 h，加入二甲基亚砜（DMSO），用自动酶标仪570 nm处测定OD值。

1.2.4 氟诱导对小鼠成骨细胞Ca2+，NO水平的影响细胞接种于含10%胎牛血清培养液中。细胞贴壁后，不同质量浓度NaF（0，5，10，30 mg/L）作用72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，调整其浓度为1×106个/mL。Ca2+和NO测定分别加入10 μL Fluo-3 AM稀释液和10 μL DAF-FMDA稀释液混匀；37℃避光孵育20 min；1 h内用流式细胞仪检测荧光强度。

2 结果与分析

2.1 氟诱导对小鼠成骨细胞形态的影响

2.1.1 HE染色由图1可知，对照组细胞形态自然，细胞核完整呈卵圆形；5 mg/LNaF作用72 h后，对成骨细胞影响不明显，少数细胞的胞质浓缩（图2）；当10 mg/LNaF作用时，一些细胞出现了明显的胞质浓缩（图3）；当高浓度30 mg/L NaF作用时表现出明显的毒性，很多细胞核膜破裂（图4）。

2.1.2 DAPI染色由图5可知，对照组细胞核完整，细胞生长旺盛；5 mg/LNaF作用72 h后，对细胞影响不明显，少数细胞的胞核固缩（图6）；10 mg/L NaF作用后，一些细胞细胞核固缩，有少量核分裂（图7）；30 mg/LNaF作用时，表现出明显的毒性，很多细胞核固缩，核分裂，有凋亡小体的形成（图8）。

2.2 氟对体外培养小鼠成骨细胞增殖的影响

氟作用24，48，72 h后，较高质量浓度的氟（30 mg/L）对成骨细胞增殖率有明显抑制作用，且差异极显著（P＜0.01）；10 mg/L氟作用24，48，72 h后，也明显抑制成骨细胞的增殖（P＜0.05）；而较低质量浓度的氟（1，5 mg/L）对成骨细胞的增殖没有明显影响。作用96 h后，5，10，30 mg/L氟均表现出明显的抑制作用，且差异极显著（P＜0.01），随氟浓度的增加抑制作用增强（表1）。

表1 氟对成骨细胞增殖（M77法）的影响

2.3 氟诱导对小鼠成骨细胞Ca2+水平的影响

流式细胞仪检测结果显示，经5 mg/L氟化钠处理72 h后，细胞荧光强度明显增加，大约是对照组的3倍；10，30 mg/L氟化钠处理的细胞荧光强度也有所增加，约为对照组的1.5倍，但不明显（图9），可能是由于成骨细胞在高氟的长时间作用下，细胞活性降低，生理反应减弱或缺失，说明氟化钠可诱导成骨细胞胞内Ca2+水平升高。

2.4 氟诱导体外培养小鼠成骨细胞NO的分析

流式细胞仪检测，经5，30mg/L氟化钠处理72 h后，成骨细胞发出了亮绿色的荧光，与对照组相比，约为对照组的1.2倍。10 mg/L处理72 h后荧光强度明显较对照组增强，约为对照组的2倍（图10）。说明氟化钠可诱导成骨细胞胞内NO水平升高。

3 讨论

3.1 氟诱导对小鼠成骨细胞形态的影响

成骨细胞是氟进入机体的主要靶细胞之一，近年来研究表明，长期氟暴露对成骨细胞增殖会产生一定影响[11]，但Ca2+和NO对成骨细胞的影响机制仍不清楚。本试验中，通过建立成骨细胞染氟模型（0，5，10，30 mg/L），观察成骨细胞形态的变化。随着氟浓度的升高，小鼠成骨细胞的病理损伤逐渐加重，高氟组损伤最明显，胞膜破裂，胞质浓缩、核膜破裂，核固缩。DAPI染色显示，随着氟浓度的升高，小鼠成骨细胞发生了显著的细胞核变，高氟组大多数细胞核固缩，核分裂，有凋亡小体的形成，表明高氟能诱导细胞发生明显凋亡迹象。

3.2 氟对体外培养小鼠成骨细胞增殖的影响

郭晓东等[12]利用氟诱导成骨细胞MC3T3-E1，表明氟能明显抑制成骨细胞MC3T3-E1增殖、诱发细胞凋亡，其抑制作用呈时间、剂量依赖性。本试验利用MTT法检测成骨细胞生长情况，结果表明，氟短期作用成骨细胞时，低剂量氟对细胞的增殖没有影响，高剂量的氟对成骨细胞主要表现为抑制作用。随着染氟时间的延长，低剂量氟对成骨细胞的增殖也出现抑制的情况。说明氟对成骨细胞的增殖作用呈现时间相关性。

3.3 氟诱导对小鼠成骨细胞Ca2+水平的测定

Ca2+作为一种重要的第2信使，在细胞生命活动中起着非常重要的作用，胞浆或线粒体内Ca2+超载是导致细胞凋亡的起始因素，同时通过直接或间接激活可触发细胞凋亡多种酶，引起细胞凋亡。通常，逆境胁迫可导致胞内Ca2+浓度升高，而高浓度的Ca2+又导致细胞活性降低，甚至凋亡[13]。王俊玲等[14]对氟致神经细胞凋亡的研究表明，过量氟会刺激Ca2+浓度增多。本试验表明，在NaF处理后，成骨细胞内Ca2+浓度显著升高，可能是因为NaF进入细胞后激活了质膜上的Ca2+通道，导致胞外Ca2+内流，胞内较高Ca2+浓度可激活Ca2+依赖性酶，使DNA发生断裂，细胞骨架破坏，最终诱导细胞凋亡；或者通过诱导胞内ROS上升使细胞凋亡。此外，Ca2+还可通过刺激PTP开放或cyt c释放，进而激活下游的细胞凋亡途径，导致细胞死亡[15]。本试验检测细胞内Ca2+浓度的升高或下降可引起细胞凋亡，由此推测，Ca2+浓度失衡是氟诱导成骨细胞凋亡的重要原因。氟致成骨细胞凋亡发生在Ca2+浓度失衡的状况下。

3.4 氟诱导体外培养小鼠成骨细胞NO的分析

NO是骨重构过程中一个重要的信号分子，它既可作用于破骨细胞抑制骨吸收，还可以作用于成骨细胞促进骨形成，NO是L-精氨酸和分子氧在NOS作用下生成的一种自由基，在很多生理或病理过程中起着信号分子的作用。很多研究表明，氟诱导可使细胞内NO浓度增加。LOREDANA等[16]研究了氟致成骨细胞毒性作用；MESQUITA等[17]研究发现，H2O2诱导的酵母细胞凋亡过程中NO水平显著升高；颜凌等[18]研究表明，小胶质细胞活化后导致细胞内ROS、培养液内NO含量增加，且与时间、剂量相关。本试验利用NO荧光指示剂DAF-FMDA检测了成骨细胞内的NO水平，结果发现，经10 mg/L氟化钠作用72 h后，成骨细胞内NO水平显著升高，可能是由于氟化钠进入生物体内，诱导线粒体内Ca2+浓度升高，激活NOS，NOS在诱导刺激下催化L-精氨酸能力加强，迅速产生大量的NO，最终导致胞内NO水平升高。表明氟在诱导成骨细胞凋亡的过程中，NO的升高产生重要作用。

4 结论

本研究在模拟氟中毒试验中，通过对小鼠成骨细胞进行HE和DAPI染色，结果发现，随着氟浓度的升高，小鼠成骨细胞的胞质和细胞核均发生了显著的病理变化；同时发现，高浓度的氟可以导致胞质形变及细胞核固缩或分裂，形成凋亡小体。高氟的刺激，使成骨细胞做出应激反应，使细胞内Ca2+，NO的浓度增加，证明氟作用小鼠成骨细胞，通过增加Ca2+，NO的浓度诱导细胞凋亡，而氟长时间的作用导致细胞凋亡甚至失去应激能力，无法产生Ca2+，NO。总之，高氟会对成骨细胞造成一定的损伤，诱导细胞凋亡，并且Ca2+，NO在此过程中起着重要的作用。但是Ca2+，NO诱导细胞凋亡的具体途径还不清楚以及氟诱导成骨细胞凋亡的主要途径还有待探究。

［1］PERUMAL E，PAUL V，GOVINDARAJAN V，et al.A brief reviewon experimental fluorosis[J].ToxicoLett，2013，223：236-251.

［2］SONG Y E，TAN H，LIU K J，et al.Effect of fluoride exposure on bone metabolismindicators ALP，BALP and BGP[J].Environ Health PrevMed，2011，16（3）：158-163.

［3］姜霞，杨雪，王秀琴.氟中毒的健康损害效应与机制的研究新进展[J].中国保健营养，2016，26（8）：23-24.

［4］YAN X，FENG C，CHEN Q，et al.Effects of sodium fluoride treatment in vitroon cell proliferation，apoptosis and caspase-3 and caspase-9 mRNA expression by neonatal rat osteoblasts[J].Archives of Toxicology，2009，83（5）：451-458.

［5］GAO X，YANG X.Neuroprotection of taurineagainst bilirubin-induced elevation ofapoptosis andintracellular free calciumion in vivo [J].Toxicol Mechanism&Methods，2011，21（5）：383-387.

［6］马轶杰，崔薇，李建华，等.热应激预处理对创伤性休克大鼠早期脑组织中一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶的表达与脑损伤的影响[J].中国现代医学杂志，2015，25（27）：14-17.

［7］CHAO C C，CHAN P，KUO C S，et al.Protection of differentiated neuronal NG108-15 cells from P2X7 receptor-mediated toxicity by taurine[J].Pharmacol Rep，2014，66（4）：576-584.

［8］ELROD J W，GREER J J，BRYAN N S，et al.Cardiomyocyte-specific overexpression of NO synthase-3 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（7）：1517-1523.

［9］SHARP BR，JONESSP，RIMMER DM，et al.Differential response to myocardial reperfusion injury in e NOS-deficient mice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282（6）：2422-2426.

［10］LIU J，WANG X，LIU Y，et al.Antenatal taurine reduces cerebral cell apoptosis in fetal rats with intrauterine growth restriction[J]. Neural Regen Res，2013，23（8）：2190-2197.

［11］SUN F，LI X，YANG C，et al.Role for PERK in the mechanismunderlying fluoride-induced bone turnover[J].Toxicology，2014，325：52-66.

［12］郭晓东，杨茂伟，梁单，等.氟诱导成骨细胞MC3T3-E1自噬与凋亡及其相互作用分析[J].中国地方病防治杂志，2012，27（3）：165-168.

［13］艾尼瓦尔·肉孜，阿不力米提·阿不都热依木，普拉提·衣布拉音.细胞内钙离子震荡的调制作用[J].南开大学学报（自然科学版），2015，48（3）：36-40.

［14］王俊玲，余谦.牛磺酸对氟致神经细胞内钙离子浓度和细胞凋亡改变的干预研究[J].毒理学杂志，2016，30（3）：189-191.

［15］宋必卫，俞巧丽.Ca2+信号调控细胞死亡的亚细胞和分子机制[J].生理科学进展，2015，46（3）：209-214.

［16］LOREDANA BERGANDIA，VALENTINA AINAB，GIANLUCA MALAVASIC，et al.The toxic effect of fluoride on MG-63 osteoblast cells is also dependent on theproduction of nitric oxide[J]. Chemico-Biological Interactions，2011，190（2）：179-186.

［17］MESQUITA ANA，WEINBERGER MARTIN，SILVA ALEXANDRA，et al.Caloric restriction or catalase inactivation extends yeast chronological lifespan by inducing H2O2and superoxide dismutase activity[J].Proceedings of the National Academyof Sciences Current Issue，2010，107（3）：15123-15128.

［18］颜凌，王菲，刘盛男，等.氟对小胶质细胞ROS和NO含量的影响[J].中国工业医学杂志，2012，25（1）：44-46.

Effects of Fluorine on the Concentration of Ca2+and NO in MC3T3-E Osteoblast of Mice

XINGYangang1，ZHANGDandan2，ZHANGWenyan3，ZHOUWenli4，YANXiaoyan1，5
（1.College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.College ofBiological Science and Technology，Shenzhen University，Shenzhen 518000，China；4.College ofBiological Science and Technology，Huanan Normal University，Guangzhou 510000，China；5.Department ofPublic Health，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China）

To explore the effects ofdifferent concentrations ofsodium fluoride on the cell morphology,the concentration of Ca2+and NO in mice MC3T3-E osteoblast,the sodium fluoride concentration gradient model was established.According to the growth curve of MTT,the effect offluoride on the proliferation ofosteoblasts was determined.DAPI and HE stainingwere used toobserve the nucleus and morphology changes.Using fluorescent probes Fluo-3 AM and DAF-FM DA labeled with fluoride osteoblasts and changes in the concentration of Ca2+and NO in osteoblasts were tested by flow cytometry.The results showed that with the increase of fluoride concentration,the cell proliferation rate decreased and the cell morphology was more variable,cytoplasmic condensation and nuclear condensation.The concentration of NO and Ca2+in osteoblast increased.The long time effect of high fluoride can decrease the activity of cell and the physiological reaction,which can affect the concentration of Ca2+and NO.This study suggests that high concentration of fluoride can inhibit cell proliferation,change the cell morphology and cell apoptosis by increasing the concentration ofCa2+and NO in the cell.

fluorine;osteoblasts;Ca2+;NO

R599.9

：A

：1002-2481（2017）06-0940-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.19

2017-05-04

国家自然科学基金项目（31240009，31302158）；山西省回国留学人员科研资助项目（2012-079）；山西省科技厅软科学项目（2013041084-03）

邢艳刚（1989-），男，山西太原人，在读硕士，研究方向：动物营养代谢调控与食品质量安全。阎小艳为通信作者。