辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突变体渗透压敏感性及交互抗性

石玉星，曹俊宇，任璐，2，刘慧平

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西太原030031）

辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突变体渗透压敏感性及交互抗性

石玉星1，曹俊宇1，任璐1，2，刘慧平1

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.农业有害生物综合治理山西省重点实验室，山西太原030031）

为了探讨辣椒炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides敏感菌株与抗啶氧菌酯突变体对渗透压敏感性的差异，室内诱导获得了C.gloeosporioides对啶氧菌酯的抗性突变体，在此基础上，对其抗感菌株渗透压敏感性及交互抗性进行了研究。结果表明，抗感菌株在供试葡萄糖浓度下均可生长，相比无糖培养基，在含有葡萄糖的培养基上菌落直径显著增加；随着培养基中NaCl浓度的升高，抗感菌株菌丝生长均受到抑制，且敏感菌株与不同抗性水平抗性突变体对高浓度NaCl渗透压均敏感，但渗透压敏感性没有显著差异。啶氧菌酯与嘧菌酯、醚菌酯、多菌灵、咪鲜胺的交互抗性测定结果显示，啶氧菌酯与同属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的嘧菌酯、醚菌酯之间存在正交互抗性，与多菌灵、咪鲜胺之间均无交互抗性产生。该研究结果可为指导生产中合理用药提供理论依据。

辣椒炭疽病菌；啶氧菌酯；渗透压敏感性；交互抗性

辣椒既有一年生植物也有多年生植物，一般在温带多为一年生草本植物，而在热带是多年生灌木[1]。辣椒是一种大众化蔬菜和调味品，是山西省蔬菜产业的主要栽培项目之一[2]。目前，国内对其研究报道主要集中在栽培技术、品种比较、病害防治以及生理等方面[3-6]。辣椒炭疽病是辣椒生产中一种常发病害，对辣椒果实的危害尤为严重，导致辣椒腐烂，失去经济价值[7]。目前，生产上运用化学杀菌剂防治辣椒炭疽病在其病害综合防治中占有重要地位，常用杀菌剂主要有芳烃类、有机硫类及苯并咪唑类杀菌剂等。由于杀菌剂的过量使用及不合理使用导致炭疽病菌对多种常用杀菌剂已产生较高水平的抗药性[8]，而病原菌一旦产生抗药性，药剂的防治效果会显著下降[9]。李洋等[10]就辽宁省葡萄炭疽菌对多菌灵敏感性测定结果显示，某些地区已产生了抗性水平较高的菌株。叶佳等[11]对浙江地区的葡萄炭疽菌群体进行抗药性研究，发现该病菌对甲基硫菌灵敏感性降低，表现出一定程度的抗药性。上述报道进一步说明，由于该类杀菌剂的施用，已出现某些植物病原菌对其敏感性下降的现象[12]。

啶氧菌酯（Picoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中内吸活性最强的，主要用于防治麦类的叶面病害如叶枯病、叶锈病、白粉病等，以及辣椒炭疽病、葡萄黑痘病等经济作物病害。啶氧菌酯通过抑制细胞线粒体氧化呼吸所必经的细胞色素b和c1之间的电子转移来阻断生物的呼吸路径，从而起到杀菌效果[13]。目前，国内对啶氧菌酯抗药性的相关报道还很鲜见。

山西农业大学农学院蔬菜病害化学防治课题组在山西省范围内采集分离的辣椒炭疽病菌经鉴定主要由Colletotrichum gloeosporioides和Colletotrichum capsici引起。啶氧菌酯作为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中的新品种，抗药性分子突变位点单一，抗药性风险较高，且啶氧菌酯还未在山西省的辣椒产区广泛应用，因此，本研究在诱导辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯抗性突变体的基础上，对其抗感菌株渗透压敏感性及交互抗性进行研究，旨在为指导生产中合理用药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌在山西省晋中市3个未使用过甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的辣椒种植区采集、分离并纯化获得45株辣椒炭疽病菌，经鉴定为Colletotrichum gloeosporioides。敏感菌株经过室内诱导得到6株低抗突变体和2株中抗突变体。

1.1.2 供试药剂95%啶氧菌酯（Picoxystrobin）原药：湖北健源化工有限公司，用丙酮制成10000μg/mL的母液，4℃保存备用。

嘧菌酯（Azoxystrobin）：陕西恒田化工有限公司，有效成分为250 g/L悬浮剂，采用无菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存备用。

醚菌酯（Kresoxim-methyl）：陕西恒田化工有限公司，有效成分为250 g/L悬浮剂，用无菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存备用。

90%多菌灵（Carbendazim）：四川国光农化有限公司，可湿性粉剂，用无菌水配成1 000 μg/mL母液，4℃保存备用。

25%咪鲜胺（Prochloraz）：河北省农药化工有限公司，用无菌水配成1 000 μg/mL的母液，4℃保存备用。

1.1.3 培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～17 g、水1 000 mL。

含药培养基：若为原药先用适量丙酮溶解，之后用蒸馏水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液（若为制剂则可直接用蒸馏水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液），用时再用无菌水配制成适合的浓度，按照药剂与培养基1∶9的比例进行稀释，轻轻摇晃混匀即可得到含药培养基（加药时应先冷却培养基至50℃左右，以防药剂在高温中不稳定）。

1.2 方法

1.2.1 抗感菌株渗透压敏感性测定选取敏感菌株JX3，SN13，YZ6与抗性突变体JX3R2，SN13R1，YZ6R2，JX3MR3，YZ6MR4共8株，采用菌丝生长速率法进行渗透压敏感性测定。

在PDA培养基中加入所需浓度的葡萄糖或NaCl，使得培养基中葡萄糖终质量浓度为10，20，40，80，100 g/L，NaCl终质量浓度为10，20，40，60，80 g/L。在已活化7 d的抗感菌株的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，分别接入含梯度浓度葡萄糖及NaCl的PDA平板上，每处理设3次重复，放置到25℃恒温培养箱中培养。6 d后，用十字交叉法测量其菌落直径（cm）。

1.2.2 交互抗性测定选取敏感菌株JX1，JX3，JX8，JX11，SN5，SN7，SN13，YZ3，YZ6，YZ13和抗性突变体JX3R1，JX3R2，SN13R1，YZ6R1，YZ6R2，YZ6R3，共16株，采用菌丝生长速率法，分别测定对醚菌酯、嘧菌酯、多菌灵和咪鲜胺的敏感性（EC50），用SPSS统计软件（IBMSPSSStatistics 20）计算相关系数r值和显著水平P值，分析啶氧菌酯与供试药剂两两间是否存在交互抗性。

2 结果与分析

2.1 抗感菌株的渗透压敏感性测定

表1 不同葡萄糖质量浓度下抗感菌株菌落直径cm

从表1可以看出，抗感菌株在供试葡萄糖质量浓度下均可生长，相比无糖培养基，在含有葡萄糖的培养基上菌落直径显著增大，说明葡萄糖在质量浓度小于100 g/L时，其提供营养的作用大于渗透抑制作用。亲本菌株JX3，SN13，YZ6与低抗突变体SN13R1，YZ6R2均在葡萄糖质量浓度为80 g/L的培养基中，菌落直径最大，而低抗突变体JX3R2和中抗突变体JX3MR3，YZ6MR4分别在葡萄糖质量浓度为40，10 g/L时最大。

由表2可知，抗感菌株菌落直径均随NaCl质量浓度升高而呈现显著下降的趋势。当NaCl质量浓度为60 g/L时，抗感菌株菌落直径均非常小；当NaCl质量浓度为80 g/L时，供试抗感菌株均不能生长。说明敏感菌株与不同抗性水平突变体对高盐浓度渗透压均都很敏感。

表2 不同NaCl质量浓度下抗感菌株菌落直径cm

2.2 交互抗性测定

参照范子耀等[14]、马建英等[15]的方法，进行线性回归分析，由图1可知，啶氧菌酯与其他4种药剂（咪鲜胺、多菌灵、嘧菌酯、醚菌酯）的显著水平P值分别为0.178，0.117，0.000和0.000。多菌灵和咪鲜胺的P值均大于0.05，在5%水平上差异不显著，说明啶氧菌酯与这2种杀菌剂之间不存在交互抗性。嘧菌酯和醚菌酯的P值均小于0.05，在5%水平上差异显著，说明啶氧菌酯与这2种杀菌剂之间存在正交互抗性。

3 结论与讨论

ELLIS等[16]研究显示，产生抗药性可能会影响渗透压的调节能力。因此，本试验制成含不同质量浓度NaCl和葡萄糖的PDA培养基用以模拟渗透压变化的环境，以此来衡量抗感菌株渗透压调节能力的大小。结果表明，相比无糖培养基，在含有葡萄糖的培养基上菌落直径会明显增加，说明了葡萄糖在质量浓度低于100 g/L时，其提供营养作用大于渗透抑制作用，且抗感菌株对于葡萄糖渗透压变化均不敏感。而在高盐环境下，抗感菌株菌落直径相比无盐环境均明显受到抑制。这一结果与ELLIS等[16]报道的病原菌在渗透压较高的情况下，需要消耗大量能量用以合成甘油来保持细胞膨压，从而度过高渗透压这种极端环境，因此，病原菌本身生长就被抑制这一结果相一致。

通过对啶氧菌酯与咪鲜胺、多菌灵、嘧菌酯与醚菌酯4种药剂的交互抗性研究表明，啶氧菌酯与醚菌酯、嘧菌酯这2种同属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂之间存在正交互抗性，与甾醇合成抑制剂杀菌剂咪鲜胺及苯并咪唑类杀菌剂多菌灵等作用机理不同的杀菌剂之间没有交互抗性。因此，在生产中应该注意避免啶氧菌酯与同类杀菌剂同时或连续使用，建议与不同作用机制杀菌剂交替使用，延缓抗药性的产生，延长药剂的使用寿命。

［1］邹学校，王鸣，郭家珍，等.中国辣椒[M].北京：中国农业出版社，2002.

［2］成妍，马蓉丽，焦彦生，等.辣椒游离小孢子培养研究进展[J].山西农业科学，2012，40（3）：288-291.

［3］乔宁，马蓉丽，王瑞丽，等.辣椒疫病的发生及抗性研究进展[J].山西农业科学，2016，44（6）：885-888.

［4］柴文臣，马蓉丽，焦彦生，等.低温胁迫对不同辣椒品种生长及生理指标的影响[J].华北农学报，2010，25（2）：168-171.

［5］陈世军，韦美玉.外源NO对辣椒幼苗生长及生理特性的影响[J].河南农业科学，2009（4）：97-101.

［6］段曦，魏佑营，曹克友，等.低温弱光胁迫及恢复过程对CMS三系辣椒幼苗保护酶活性与渗透调节物质的影响[J].天津农业科学，2012，18（1）：11-15.

［7］刘忠，宋满刚.辣椒炭疽病的发生及综合防治技术[J].内蒙古农业科技，2007（7）：11-16.

［8］汪晓红，潘万明，陈茜.啶氧菌酯250克/升悬浮剂防治辣椒炭疽病、葡萄黑痘病田间试验研究[J].农药科学与管理，2012，33（8）：59-62.

［9］OU J F，TU H，SHAN B，et al.Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c（SREBP-1c）gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，98（11）：6027-6032.

［10］李洋，刘长远，陈秀蓉，等.辽宁省葡萄炭疽菌鉴定及对多菌灵敏感性研究[J].植物保护，2009，35（34）：74-77.

［11］叶佳，张传清.葡萄炭疽病菌对甲基硫菌灵、戊唑醇和醚菌酯的敏感性检测[J].农药学学报，2012，14（1）：111-114.

［12］YOUNG J R.Two mutations in β-tubulin 2 gene associated with thiophanate-methyl resistance in Colletotrichum cereale isolates from creeping bentgrass in Mississippi and Alabama[J].Plant Disease，2010，94（2）：207-212.

［13］BARTLETT D W，CLOUGH J M，GODWIN J R.The strobilurin fungicides[J].Pest Management Science，2002，58（7）：648-663.

［14］范子耀，孟润杰，韩秀英，等.马铃薯早疫病菌对咯菌腈的敏感基线及其对不同药剂的交互抗性[J].植物保护学报，2012，39（2）：155-156.

［15］马建英，张小风，王文娇，等.灰葡萄孢霉Botrytis cinerea对啶菌恶唑的敏感性和不同杀菌剂的交互抗性[J].植物保护学报，2009，36（1）：63.

［16］ELLIS S W，GRINDLE M.Effect of osmotic stress on yield and polyolcontent of discarboximides sensitive and resistant of Neurospora crassa[J].Mycol Res，1991，95（4）：457-464.

Osmotic Pressure Sensitivity and Cross-resistance ofColletotrichum gloeosporioidesResistant Mutants to Picoxystrobin

SHI Yuxing1，CAOJunyu1，RENLu1，2，LIUHuiping1
（1.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi Province KeyLaboratoryofIntegrated Pest Management in Agriculture，Taiyuan 030031，China）

To investigate the osmotic pressure sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides picoxystrobin-resistant mutants and sensitive strains,the research induced and obtained C.gloeosporioides resistant mutants to picoxystrobin.On this basis,the osmotic pressure sensitivity and the cross-resistance were studied.The results showed that all isolates could growwell on the PDA medium with all of glucose concentrations and the colony diameters increased obviously in the medium containing glucose compared with no glucose. But all isolates grew poor with the increase of NaCl concentration and both resistant and parent sensitive isolates were sensitive to high NaCl concentration.The results of cross-resistance showed that picoxystrobin had positive cross-resistance with azoxystrobin and kresoxim-methyl,while no cross-resistance was detected between picoxystrobin and other type fungicides,such as carbendazim and prochloraz.The research results provide theoretical basis for the guidance of pesticides use in production.

Colletotrichum gloeosporioides;picoxystrobin;osmotic pressure sensitivity;cross-resistance

S436.418.1＋1

：A

：1002-2481（2017）06-1002-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.34

2017-01-13

农业有害生物综合治理山西省重点实验室开放课题（YHSW2015002）

石玉星（1993-），女，山西临汾人，在读硕士，研究方向：农药毒理与生物农药。刘慧平为通信作者。