LRP1B在宫颈鳞癌中的表达与意义

刘 磊，任明永，成荣杰，朱 莉

(哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨医科大学附属第一医院儿科，黑龙江 哈尔滨 150007)

LRP1B在宫颈鳞癌中的表达与意义

刘 磊1，任明永2，成荣杰1，朱 莉1

(哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨医科大学附属第一医院儿科，黑龙江 哈尔滨 150007)

目的 探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1B (LRP1B)在宫颈鳞癌中的表达与意义。方法 选用原位杂交的检测方法，用LRP1B寡核苷酸探针对20例正常的宫颈组织和40例宫颈鳞癌组织标本中LRP1B mRNA表达进行测定，用HPV16/18探针对40例宫颈鳞癌标本组织进行检测。结果 在40例宫颈鳞癌标本中，有22例呈现LRP1BmRNA低表达，在20例正常宫颈组织中，仅有3例呈现低表达，癌症组的阴性表达率明显低于正常组织，且两组之间的差异具有统计学意义(χ2=5.28，P<0.05)。宫颈鳞癌组中，LRP1B阴性者的HPV16/18阳性率明显高于LRP1B阳性者，差异有统计学意义(χ2=5.56，P<0.05)。在40例宫颈鳞癌标本中，LRP1BmRNA的表达与患者的年龄、临床分期、肿瘤分化程度均无关(χ2值分别为0.22、4.65、0.90，均P<0.05)；但在发生浸润至浆膜层和淋巴结转移的标本中呈现低表达，差异有统计学意义(χ2值分别为4.85、6.15，均P<0.05)。结论 LRP1B在宫颈鳞癌组织中呈低表达与HPV16/18感染很可能作为协同因子参与宫颈癌的发生，并且LRP1B与宫颈鳞癌发病和转移有较密切的关系。

宫颈鳞癌；LRP1B；原位杂交；HPV16/18

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，尽管宫颈癌筛查已经广泛开展，但其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中仍然居高不下。根据世界范围内的统计，每年大约有50万新发的宫颈癌病例，而且其发病人数逐年升高，年龄趋于年轻化。宫颈癌新发病例占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例来自于发展中国家。因此，该病的发生、转移和复发机制的研究具有重要意义。低密度脂蛋白受体相关蛋白1B(low density lipoprotein receptor-related protein 1B，LRP1B)是新进发现的一个候选抑癌基因，该蛋白相应的编码基因最早在2000年由Liu等[1]利用对非小细胞肺癌细胞系染色体做纯合缺失分析时发现。Li等[2]研究显示它在人类正常和肿瘤细胞中广泛的表达，并调控肿瘤细胞黏附、增殖、分化和血管生成。大量的研究显示在人类多种恶性肿瘤，如食管鳞癌[3]、口腔鳞癌[4]、神经胶质瘤[5]、急性白血病[6]等，均存在LRP1B基因异常转录和表达缺失，发生的确切作用机制与其mRNA纯合子的缺失和富含双核苷酸“CG”的区域(CpG island，CpG岛)甲基化增强有关系，也有研究表明LRP1B是高级别尿路上皮癌中的一个候选抑癌基因[7]。因为宫颈癌中主要类型为宫颈鳞癌，并且有研究先后在非小细胞肺癌、食管鳞癌、口腔鳞癌等鳞状细胞癌中发现LRP1B的表达异常，所以本研究就采用原位杂交技术观察并检测LRP1B在宫颈鳞癌和宫颈正常组织中表达的相关性,旨在探讨LRP1B表达与宫颈鳞癌及人乳头瘤状病毒(Human papilloma virus，HPV)感染、患者年龄、临床分期、分化程度、浸润及淋巴转移间可能存在的关系和意义。

1材料及方法

1.1标本及试剂

1.1.1标本来源和处理

本实验实验组标本均选自黑龙江省哈尔滨医科大学附属第四医院病理科，选取2014年至2016年在本院经过手术证实为原发性宫颈鳞癌的手术标本腊块40例。宫颈癌标本中按国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)制定的分期(2009)来分，原位癌4例，Ⅰ期21例，Ⅱ期15例。其中按组织分化程度分为：高分化12例，中分化17例，低分化7例。其中浸润至浆膜的10例，未浸润至浆膜的有30例。发生淋巴转移的有11例，未发生淋巴转移的有29例。实验组术前均未接受放、化疗。患者年龄最小30岁，最大年龄72岁。

1.1.2主要试剂

LRP1B试剂盒、HPV16/18探针及3,3二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验步骤严格按照LRP1B试剂盒说明进行。

1.2方法

1.2.1石蜡切片

标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛。常规脱水、浸蜡，包埋后作4μm连续切片。切片捞片后，简单烘干。

1.2.2原位杂交

标本泡片烤干后，进行脱蜡和脱二甲苯。经过3%过氧化氢温室处理30分钟，胃蛋白酶消化后进行预杂交和杂交。滴加封闭液后滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加生物素化过氧化物酶后加DAB显色。镜下控制反应时间。苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明后烘干封片。采用多相寡核苷酸探针和高度敏感标记技术，用LRP1B探针及HPV探针分别经过地高辛标记，进行原位杂交实验。

1.3结果判读

检出棕黄色颗粒视为阳性细胞。主要分布在细胞胞浆中。本实验根据棕色反应的阳性强度及细胞数量计算免疫反应评分(immunoreactive score，IRS)，免疫反应评分(IRS)=染色强度(staining intensity，SI)×阳性标本的百分率(percentage of positive specimens，PP)。在高倍镜下(×400)随机对每张切片选取5个视野，并且每个视野选取100个肿瘤细胞，将表达最强的部分按着色程度分为：基本未着色，染色与背景相似者为0分；着色浅，略高于背景者为1分；中度着色，明显高于背景者为2分；强染，着色深棕色者为3分。阳性细胞数<10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。每一个标本分别计算IRS，0～3分为低表达或缺失，记做(-)；≥4分为正常表达，记做(+)。

1.4统计学方法

运用SPSS 16.0软件，应用χ2检验方法，检验标准α=0.05，P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1 LRP1B基因在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达

镜下示LRP1B主要定位于细胞浆内，见图1和图2。40例宫颈鳞癌组织中，LRP1BmRNA阳性表达有18例(45.00%)，阴性表达有22例(55.00%)。在20例正常宫颈对照组中，阳性表达有17例(85.00%)，阴性表达有3例(15.00%)。实验组和对照组之间表达差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 宫颈鳞癌组织中HPV16/18 E6与LRP1B蛋白表达之间的关系

在28例HPV16/18 E6蛋白表达阳性者中有16例LRP1B蛋白表达为阴性，而在12例HPV16/18 E6蛋白表达阴性者中仅有2例LRP1B蛋白表达为阴性，二者有明显相关性(χ2=5.56，P<0.05)，见表2。

图1 LRP1B在正常宫颈组织中的表达(×400)；

图2 LRP1B在宫颈鳞癌组织中的表达(×400)

表1 LRP1B在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中的表达情况(n)

Table 1 Expressions of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma and normal cervix(n)

表2 宫颈鳞癌组织中LRP1B与HPV16/18蛋白表达的关系(n)

Table 2 Correlation between expression of LRP1B and HPV16/18 in cervical squamous cell carcinoma(n)

2.3 LRP1B的表达与宫颈鳞癌临床特征之间的关系

LRP1B在实验组标本中的表达与患者的年龄、不同临床分期及组织分化程度上均未显示出统计学意义。但在肿瘤浸润程度方面，浸润至浆膜的LRP1B的表达(阴性表达率为80.00%)，与未浸润至浆膜的LRP1B表达(阴性表达率为33.33%)两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。在淋巴转移方面，发生淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌LRP1B的表达(阴性表达率为87.50%)，与未发生淋巴转移的之间的表达(阴性表达率为31.25%)两者之间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 宫颈鳞癌中LRP1B的表达与临床病理参数的关系(n)

Table 3 Correlation between clinical pathological parameters and expression of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma(n)

3讨论

3.1宫颈癌与HPV感染的关系

宫颈癌是以鳞状细胞癌为主的女性生殖道恶性肿瘤。近年来发病趋势逐年上升，发展中国家发病人数较多，严重危害妇女身心健康。多年来人们一直在研究宫颈癌的发病机制，高危型HPV已经是公认的宫颈癌和癌前病变发病的重要危险因素，有研究表明，高危型HPV与宫颈鳞状细胞癌之间关系的密切程度高于吸烟与肺癌之间的联系。在一些调差中，其相关性甚至高达近100%。近20余年，人们积累了大量的关于HPV和宫颈肿瘤的研究，结果表明HPV是引起宫颈癌的必须条件，但不是充分条件。杜亚丽等[8]回顾性分析2014年1月至2014年12月份无锡市共2 670例妇科HPV基因型检验结果，发现HPV16型是当地优势感染型别，HPV35，39，45在多重感染中占优势。方婧等[9]研究404例有效样本，发现高危型HPV核酸检测试剂盒-care HPV在检测出HPV感染上具有很好的灵敏度和特异性，且用时短，有可能成为医疗资源贫乏地区宫颈癌筛查的主要方法。

3.2 LRP1B与HPV的关系

在研究LRP1B与HPV的关系时，国外有文献报道，高危型HPV16和HPV18均可以与2号染色体上的LRP1B相应结合位点相互结合。也有文献显示，2号染色体上也有HPV45与LRP1B的结合位点。这就为HPV与LRP1B相互协同作用而导致宫颈癌的发生并促进宫颈鳞癌的发生发展提出依据。

任何恶性肿瘤都是环境与基因的共同作用，其中抑癌基因的失活起了至关重要的作用，自2000年LRP1B基因首次从非小细胞肺癌中分离出之日起，该基因就与潜在的抑癌功能联系在一起。本研究探索LRP1B基因在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达，及其与HPV16/18感染和宫颈鳞癌的病理特征之间的关系，为研究宫颈癌的病因及疾病进展机制提供一个新的思路。

3.3 LRP1B参与肿瘤发生发展可能存在

有研究显示，LRP1B通过与尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)上的位点相结合，可以负性调节uPA系统。而uPA系统可以改变细胞基底膜的活动性，使细胞外基质降解，在肿瘤细胞的迁徙、浸润和转移过程中起到促进的作用。盛修贵等[10]采用ELISA法检测42例子宫颈癌病人和10例良性子宫肿瘤病人的血浆和组织中uPA含量，得出的结论是检测宫颈癌病人uPA含量可能对其侵犯范围、盆腔淋巴结转移情况、预后等有一定的参考价值。

此外，uPA系统还可以打破色素上皮源因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的平衡。色素上皮源因子是一种仅对新生的异常血管起抑制作用的因子，而对正常血管无杀伤作用。血管内皮生长因子则是一种促血管生成因子，与肿瘤血管的生成有密切关系。肿瘤的发生与两种因子表达失衡及新血管生成有密切关系，目前已经有研究表明两种因子在肝癌、肾癌、喉癌[11]中均存在PEDF或VEGF表达的异常。所以LRP1B是否通过负性调节uPA系统进而影响PEDF和VEGF的平衡来参与肿瘤的发生发展，仍然有待进一步的研究。

我们的研究显示：40例宫颈鳞癌标本中LRP1B的含量明显低于正常宫颈组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。证实了宫颈鳞癌的发生与LRP1B表达异常密切相关。LRP1B阴性者的HPV16/18E6阳性率明显高于LRP1B阳性者，差异有统计学意义，表明LRP1B与HPV可能共同作用参与宫颈鳞癌的发生。同时，本资料显示，宫颈鳞癌中LRP1B的异常表达与宫颈鳞癌患者的年龄、临床分期和组织分化无关(P>0.05)，但与癌症的浸润程度、淋巴转移有关(P<0.05)，证实了宫颈鳞癌的转移与LRP1B异常表达密切相关。

总之，宫颈癌的发生发展是一个复杂的过程，LRP1B可能同HPV感染一起参与宫颈鳞癌的发生，并且该基因的失活可能促进疾病的进展，研究该基因希望可以进一步揭开宫颈癌的发病及疾病进展原因，为将来宫颈癌的预防、筛查和治疗提供一个重要的新思路。

[1]Liu C X,Musco S,Lisitsina N M,etal.LRP-DIT, a putative endocytic receptor gene, is frequently inactivated in non-small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Res,2000,60(7):1961-1967.

[2]Li Y,Lu W,Bu G.Striking differences of LDL receptor-related protein 1B expression in mouse and human[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,333(3):868-873.

[3]Sonoda I,Imoto I,Inoue J,etal.Frequent silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) expression by genetic and epigenetic mechanisms in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2004,64(11):3741-3747.

[4]Nakagawa T,Pimkhaokham A,Suzuki E,etal.Genetic or epigenetic silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B expression in oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Sci,2006,97(10):1070-1074.

[5]Tabouret E,Labussière M,Alentorn A,etal.LRP1B deletion is associated with poor outcome for glioblastoma patients[J].J Neurol Sci,2015,358(1-2):440-443.

[6]庄德丽,任丽红,孙晓晗,等.肿瘤低密度脂蛋白受体相关蛋白(即LRP1B)在急性白血病中的表达[J].现代生物医学进展,2010,10(16):3046-3049.

[7]Langbein S,Szakacs O,Wilhelm M,etal.Alteration of the LRP1B gene region is associated with high grade of urothelial cancer[J].Lab Invest,2002,82(5):639-643.

[8]杜丽亚,任春霞,吕蓓,等.2670例妇女宫颈HPV感染筛查结果回顾性分析[J].中国妇幼健康研究,2016,27(S1):328-329.

[9]方婧,洪颖.高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒-Care HPV用于宫颈癌及癌前病变筛查的临床价值[J].中国妇幼健康研究,2016,27(4):457-459.

[10]曲牟文,盛修贵,魏玲.子宫颈癌患者尿激酶型纤溶酶原激活物和抑制物的表达及其临床意义的研究[J].肿瘤防治杂志,2003,10(8):821-824.

[11]王海涛,王莹,金宏林,等.人喉鳞状细胞癌组织中VEGF-C的表达与淋巴结转移的关系[J].中国实验诊断学,2009,13(1):66-68.

[专业责任编辑：张忠明]

Expression and significance of low density lipoprotein receptor-related protein 1B in cervical squamous cell carcinoma

LIU Lei1, REN Ming-yong2, CHENG Rong-jie1, ZHU Li1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangHarbin150001,China;2.DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangHarbin150007,China)

Objective To identify the expression and significance of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) in cervical squamous cell carcinoma. Methods Hybridization in situ was used. Expression of LRP1B mRNA in 20 normal cervical tissues and 40 cervical squamous cell carcinoma specimens was detected with application of LRP1B oligonucleotide probe. HPV16/18 probe was used to detect 40 cervical squamous cell carcinoma specimens. Results In cervical squamous cell carcinoma specimens of 40 cases, 22 cases showed low expression of LRP1B, but in 20 cases of normal cervical tissues, only 3 patients showed low expression. Negative expression rate in cancer tissues was significantly lower than that in normal ones and difference between them was statistically significant (χ2=5.28,P<0.05). In cervical squamous cell carcinoma group, HPV16/18 positive rate in LRP1B negative patients was significantly higher than that in LRP1B positive patients, and difference was statistically significant (χ2=5.56,P<0.05). In cervical squamous cell carcinoma specimens of 40 cases, expression of LRP1B mRNA was not associated with patient’s age, clinical stage and degree of tumor differentiation (χ2value was 0.22, 4.65 and 0.90, respectively, allP<0.05), but specimens with serous membrane infiltration and lymph node metastasis showed low expression and difference was significant (χ2value was 4.85 and 6.15, respectively, bothP<0.05). Conclusion Low expression of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma tissues shows that LRP1B may be a new tumor suppressor gene. Changes of LRP1B gene and HPV16/18 infection may participate in occurrence of cervical cancer as co-factors. And LRP1B may have a close relationship with occurrence and metastasis of cervical squamous cell carcinoma.

cervical squamous cell carcinoma; low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B); hybridization in situ; HPV16/18

2017-01-06

2014省黑龙江教育厅立项资助项目(编号：12541267)

刘 磊(1984-)，女，住院医师，硕士，主要从事妇产科临床工作。

朱 莉，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.05.003

R711.7

A

1673-5293(2017)05-0495-03