Aβ310多价腺病毒疫苗鼻粘膜免疫阿尔茨海默病转基因鼠的炎症反应研究

李 昱， 宋贵军， 林璐璐， 辛世萌， 曹云鹏

Aβ310多价腺病毒疫苗鼻粘膜免疫阿尔茨海默病转基因鼠的炎症反应研究

李 昱1， 宋贵军1， 林璐璐1， 辛世萌1， 曹云鹏2

目的 探讨基因重组腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠诱导的炎症反应。方法 18只雄性10月龄APPswe/PSEN1dE9鼠，随机分为3组，分别以Aβ3-10多价腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG、空腺病毒载体鼻粘膜免疫及Aβ1-42肽肌内注射免疫，用MTT法检测脾细胞增殖反应、ELISA法检测脾细胞培养上清和脑组织匀浆中IL-4和INF-γ水平，免疫组化法检测脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润。结果 Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组，在相对应的免疫原刺激孔产生较高水平的增殖率，高于非相应免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔(P<0.05)。皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为：空腺病毒载体组>Aβ1-42组>Ad-Aβ(3-10)10-CpG组。各组小鼠脑组织在血管内和脑实质偶尔发现个别CD3、CD5阳性细胞，3组没有显著差异。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组中在其相对应的免疫原刺激时检测到较高水平的IL-4、IFN-γ。Aβ1-42组在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平显著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IL-4水平大于Aβ1-42组，但没有显著性差异(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆中IFN-γ水平显著小于Aβ1-42组(P<0.05)。结论 腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9双转基因鼠主要产生Th2型免疫应答，可以减少脑内星形胶质细胞活化，未引起脑内炎症反应，即避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎症反应。

阿尔茨海默病； 淀粉样蛋白； 炎症反应； 星形胶质细胞

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是痴呆最常见的类型，但发病机制不明确，尚无有效的防治方法，是全世界急需解决的健康问题。早期研究发现，用Aβ1-42肽免疫PDAPP鼠可以减少脑内淀粉样沉积，使转基因鼠学习和记忆能力提高。但后期Aβ疫苗(AN1792)临床试验由于Ⅱa期临床试验6%的患者出现了中枢神经系统炎症而被迫停止。这种副作用确切原因不清楚，推测与Aβ的T细胞抗原决定簇特异性的细胞免疫应答引起的炎症反应有关[1]。后续免疫治疗研究集中在改变免疫原和免疫方式来克服不恰当的T细胞应答引起的中枢神经系统炎症。炎症反应不但是AD的主要发病机制之一[2]，而且与免疫治疗的效果及疫苗的安全性密切相关。免疫治疗后进一步激活胶质细胞吞噬，参与Aβ斑的清除，但激活的胶质细胞可释放神经毒性细胞因子进而损害脑组织[3]。一种理想的疫苗，不但要有良好的治疗效果，而且不能激活体内过度的炎症反应，引起中枢神经系统炎症。

本研究前期工作已成功构建编码10次重复N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，并发现鼻粘膜免疫AD转基因鼠可以减少脑内Aβ沉积并改善转基因鼠的学习和记忆功能[4，5]。本研究进一步通过脾细胞增殖反应、细胞因子测定、脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润检测来探讨腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9鼠诱导的炎症反应。进一步评估腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 18只10月龄APPswe/PSEN1dE9鼠，雄性，每只鼠出生后均完成鼠尾DNA鉴定，购自中国医科大学动物部。APPswe/PSEN1dE9鼠表达鼠/人嵌合的淀粉样蛋白前体(Mo/HuAPP695swe)和突变的人早老素1(PS1-dE9)，这两种突变与早发性AD相关。随机分为3组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 组、空腺病毒载体组、Aβ1-42组，每组6只。Aβ1-42多肽(AnaSpect)，完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，不完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，小鼠IL-4 ELISA 试剂盒(Bender Med Systems@ BMS613)，小鼠 IFN-γ ELISA试剂盒(Bender Med Systems@ BMS006)，抗GFAP(武汉博士德)，兔抗小鼠CD3(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD5(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD45(Sigma，USA)。

1.2 实验动物及免疫方法 Ad-Aβ(3-10)10-CpG组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；空载体组：空载体10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42组：第1次免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+完全性弗氏佐剂(Sigma，USA)50 μl，股四头肌肌内注射，第2次及以后免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+不完全性弗氏佐剂(Sigma，USA)50 μl，股四头肌肌内注射，每2 w免疫1次，共免疫7次。

1.3 MTT法检测脾T淋巴细胞增殖反应 新鲜脾脏置于罩在装有1640培养基的培养皿上的尼龙网(200 μm)上研磨，将细胞及培养基移至15 ml离心管，离心1000 r/min，4 ℃，10 min。弃上清，加入红细胞裂解液3 ml，混匀，室温静置5 min。加入7 ml 1640培养基，混匀，离心1000 r/min，4 ℃，10 min，重复上述过程1次。弃上清，加入含10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞。取少量细胞液稀释50倍，用细胞计数板计数细胞，根据计数结果，将细胞液稀释至5×106/ml。将细胞液接种至96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 μl。分别设置对照孔(只加细胞液)、ConA孔(含ConA终浓度2 μg/ml的细胞液)、Aβ3-10孔(含Aβ3-10终浓度20 μg/ml的细胞液)、Aβ1-42孔(含Aβ1-42终浓度20 μg/ml的细胞液)，每种刺激因素设6个复孔，每个96孔板设6个调零孔(加入100 μl含10%胎牛血清的1640培养基，不含脾细胞及刺激蛋白)。置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养72 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，放入37 ℃含5%CO2培养箱中培养4 h。取出，用孔板离心机离心2000 r/min，4 ℃，10 min，收取上清-70 ℃保存。每孔加入150 μl DMSO，手摇孔板，待结晶全部溶解，用酶标仪在492 nm处测定各孔的吸光度(OD)值。各刺激抗原脾细胞增殖率=(各刺激抗原OD平均值-调零孔OD平均值)/(对照孔OD平均值-调零孔OD平均值)。

1.4 ELISA法检测细胞培养上清及脑组织匀浆中的IL-4和IFN-γ水平 取小鼠左侧半球脑组织，按湿重1：10加入0.2 M PBS，用超声波细胞粉碎机(Xinyi-ILD)匀浆，离心 10000 r/min，5 min，4 ℃，取上清分装-20 ℃保存。取脑组织匀浆及脾细胞培养上清，按照IL-4(Bender Med Systems@ BMS613)、IFN-γ(Bender Med Systems@ BMS006)试剂盒说明书操作。采用酶标仪(Elx800，BIOTEK)于450 nm处测定吸光度值(OD)，根据标准曲线计算出各样本IL-4、IFN-γ的浓度。

1.5 免疫组化法检测脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润 石蜡包埋的大脑右侧半球，按冠状位切片，厚约4 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%双氧水37 ℃孵育10 min以阻断灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修复，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封闭，37 ℃，10 min，倾去勿洗；检测星形胶质细胞滴加兔抗小鼠GFAP 抗体(1∶200)，检测淋巴细胞浸润滴加兔抗小鼠CD3，CD5，CD45(1∶200)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加生物素标记相应的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木素复染5 min，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。应用Polymer双染检测试剂盒(Zhongshan Golden bridge Biotechnology，China)对小鼠脑内星形胶质细胞与Aβ沉积进行双重标记。一抗为小鼠抗Aβ抗体(1∶200)和抗GFAP(1∶200)混合物，二抗为生物素标记的二抗混合物。图像分析应用MetaMorph显微图像分析系统，计算GFAP阳性细胞所占面积百分比。

2 结 果

2.1 脾淋巴细胞增殖反应 各组小鼠的脾细胞分别用Aβ3-10肽，Aβ1-42肽及ConA刺激，用MTT法检测体外脾细胞增殖率。加入刺激物培养72 h后，ConA在各组中都产生最高水平的增殖率，组间没有显著差异(P>0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在Aβ3-10肽及Aβ1-42肽刺激孔产生较高水平的增殖率，高于非相应免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔产生的增殖率(P<0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔产生的增殖率和Aβ1-42组Aβ1-42肽刺激孔的增值率无显著差异(P>0.05)(见图1)。

2.2 脾细胞培养上清及脑组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平检测 ConA刺激孔在各组中可检测到非常高水平的IL-4、IFN-γ，对于IL-4各组间比较无差异(P>0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组当分别给予其相对应抗原刺激时检测到较高水平的IL-4、IFN-γ，但都明显低于ConA刺激产生IL-4、IFN-γ水平(P<0.01)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组分别在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔的IL-4水平无显著差异(P>0.05)。Aβ1-42组在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平显著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)。空腺病毒载体组在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔都产生较低水平的IL-4、IFN-γ。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IL-4水平大于Aβ1-42组，但没有显著性差异(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组脑组织匀浆IL-4水平大于空腺病毒载体组(P<0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IFN-γ水平大于空腺病毒载体组(P<0.05)小于Aβ1-42组(P<0.05)(见图2)。

2.3 免疫治疗后APPswe/PSEN1dE9鼠脑内星形胶质细胞 在每张抗GFAP单染片子的皮质及海马区各采集4张400倍图像，采用MetaMorph显微图像分析系统，计算GFAP阳性细胞所占面积百分比，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和空腺病毒载体组相比皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为分别减少28.5%和24.1%(P<0.05)。Aβ1-42组和空腺病毒载体组相比皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为分别减少17.5%和19.3%(P<0.05)(见图3)。双染显示GFAP阳性细胞呈深蓝色、Aβ沉积呈深棕色，GFAP阳性细胞数量及被激活的形态随着Aβ沉积数量改变而改变，GFAP阳性细胞分布于Aβ沉积的周围及内部，对Aβ沉积呈现明显的趋向聚集现象。空腺病毒载体组：皮质及海马区GFAP阳性细胞密集分布，呈深棕褐色，胞浆明显增大，突触增多，皮质区多于海马区，GFAP阳性细胞密集分布于老年斑周围及内部；Aβ1-42组：GFAP阳性细胞形态上与空腺病毒载体组相比较，胞浆变小，突触变少，稀疏分布于老年斑周围及内部；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组：GFAP阳性细胞，形态上胞浆更小，突触更少，零星分布于淡红色颗粒状老年斑周围及内部(见图4)。

2.4 脑组织内淋巴细胞浸润检测 免疫后各组小鼠脑组织用免疫组化法检测CD3，CD5和CD45阳性淋巴细胞。三组小鼠血管内和脑实质可以偶尔发现少量CD3，CD5阳性细胞，三组小鼠均未观察到CD45阳性细胞。三组小鼠免疫组化结果未见明显差异(见图5)。

图1 体外脾T淋巴细胞增殖率。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在相对应抗原刺激时产生较高水平的增殖率，*与空腺病毒载体组比较P<0.05，#与Aβ1-42组比较P>0.05

3 讨 论

研究表明小鼠和人的Aβ分子的B细胞抗原决定簇定位在Aβ1-15，T细胞抗原决定簇定位在Aβ的中间区域和C末端[6]。本研究用编码10次重复N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫AD转基因鼠，通过MTT法检测体外脾T淋巴细胞增殖反应来观察Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起的免疫反应只针对Aβ的B细胞抗原决定簇还是Aβ全肽段。脾T淋巴细胞增殖反应结果显示：只有当Ad-Aβ(3-10)10-CpG组给予Aβ3-10刺激时能产生较高的增殖率，提示Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起了针对Aβ的B细胞抗原决定簇(Aβ3-10)，而不是Aβ全肽段的免疫应答。这样可以避免T细胞抗原决定簇特异性的细胞免疫应答引起的炎症反应。近期研究也发现编码Aβ3-10的质粒疫苗也能引起针对Aβ的B细胞抗原决定簇的免疫应答[7]，同时减少脑内炎症反应。

CD4+T辅助细胞可以分为五种功能性亚群，分别为Th1，Th2，Th3，Th7和调节性T细胞(Tregs)[8]，其中Th1和Th2是两个重要的功能性亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等因子，Th1介导细胞免疫、细胞毒性T细胞和巨噬细胞活化；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-8等因子，Th2介导体液免疫、B细胞和嗜酸性粒细胞活化。其中IL-4、IFN-γ是判断Th细胞类型的主要细胞因子[9]，因此通过检测细胞因子，可以判断免疫所刺激的Th细胞类型。在脾细胞培养上清中，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在相应抗原刺激时分泌较多的IL-4、IFN-γ，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组IL-4水平差别不明显，说明两组诱导的Th2反应相当，但Aβ1-42组IFN-γ水平明显高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组，说明Aβ1-42诱导了明显的Th1反应。Aβ1-42组脑组织匀浆中IFN-γ水平明显高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组，说明Aβ1-42上调了与炎症反应有关的IFN-γ释放。细胞因子检测结果提示：Ad-Aβ(3-10)10-CpG比Aβ1-42多肽疫苗减少了诱导与神经系统炎症有关的Th1免疫应答的趋势。

免疫后三组小鼠血管内和脑实质可以偶尔发现少量CD3，CD5阳性细胞，三组小鼠均未观察到CD45阳性细胞。这与AD患者接受Aβ1-42疫苗后发生脑膜脑炎的病理改变不同[1]。这与以往的研究结果相似[7，10]。说明Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫没有引起脑膜脑炎的潜在危险。

在AD患者脑组织中，Aβ斑块周围有明显的星形胶质细胞活化，APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠脑内星形胶质细胞聚集与Aβ沉积明显相关。星形胶质细胞可以产生炎性因子，促进Aβ聚集和纤维化转化[11]。研究表明，星形胶质细胞可以内化和降解Aβ，超微结构观察发现星形胶质细胞通过延长突起将神经元和纤维化Aβ分离，将Aβ内吞至内体/溶酶体[12]。进一步研究发现，Aβ聚集和被星形胶质细胞内吞通过改变神经元的代谢严重影响其活性[13]。在本研究中，GFAP阳性细胞所占面积百分比在Aβ1-42组及Ad-Aβ(3-10)10-CpG组明显减少，说明随着Aβ斑块的清除对胶质细胞的激活减少，Ad-Aβ(3-10)10-CpG可以下调对星形胶质细胞的激活，减少了胶质细胞活化对神经元的损害。

综上所述，腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9转基因鼠主要产生Th2型免疫应答，可以减少脑内星形胶质细胞活化，没有引起脑内炎症反应，避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎症反应。基因重组腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG具有良好的安全性。

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Inflammatory response after intranasal inoculation with an adenovirus vaccine encoding multivalent Aβ3-10in Alzheimer’s disease transgenic mice

LIYu，SONGGuijun，LINLulu，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China)

Objective To study the inflammatory response after intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG in APPswe/PSEN1dE9 transgenic mice. Methods Eighteen ten-month old male APPswe/PSEN1dE9 mice were divided into three groups and immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG，empty adenoviral vector and Aβ1-42peptide，representatively. SpleenT-cell proliferation response was determined with MTT assay. Levels of IL-4 and INF-γ in spleen cell culture supernatant and brain homogenate were determined with ELISA. Astrocytes and CD3，CD5 and CD45 positive cells in the brain were detected with immunohistochemistry. Results Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42peptide group showed higher levels of proliferation rate restimulated with its corresponding antigen(P<0.05)，but lower than the ConA-stimulated wells(P<0.05). The percentage of area of GFAP positive cells in cortex and hippocampus was as follows：empty vector group>Aβ1-42peptide group>Ad-Aβ(3-10)10-CpG group. A very few CD5-positive and CD3-positive lymphocytes were occasionally observed within the blood vessels or in the parachyma in all three groups of mice. There were no significant different in all three groups. Ad-Aβ(3-10)10-CpG and Aβ1-42peptide group exhibited significantly greater IL-4 and IFN-γ levels in the cultures of spleen T cells restimulated with its corresponding antigen. Mice immunized with Aβ1-42peptide exhibited the greater IFN-γ levels in spleen T cells restimulated with Aβ1-42peptide than mice immunized with Ad-Aβ(3-10)10-CpG(restimulated with Aβ3-10)(P<0.05). IL-4 levels in brain homogenates from mice of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group were greater than that of Aβ1-42peptide group，but the diffrence was not significant(P>0.05). IFN-γ levels in brain homogenates of Aβ1-42peptide group was greater than that of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group(P<0.05). Conclusion Intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG appeared to induce a Th2 type immune response and reduction of astrocytosis without causing neuroinflammation in the brain. Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause autoimmune response caused by Aβ1-42peptide.

Alzheimer’s disease； β-amyloid； Inflammatory response； Astrocyte

图2 脾淋巴细胞培养上清及脑组织匀浆的IL-4/IFN-γ水平测定。(A)(B)脾细胞培养上清中IL-4/IFN-γ。(C)(D)脑组织匀浆中IL-4/IFN-γ。在相应抗原刺激时脾淋巴细胞培养上清有较高水平的IL-4(A)和 IFN-γ(B)。(A)*和空载体组比较P<0.05，#和Aβ1-42组比较P>0.05。(B)*和Ad-Aβ(3-10)10-CpG组与空载体组比较P<0.05，# 与空腺病毒载体组比较P<0.05。(C)*和空腺病毒载体组比较P<0.05，#和Aβ1-42组比较P>0.05。(D)* 和空腺病毒载体组比较P<0.05，# 和Aβ1-42组比较P<0.05

图3 免疫后各组小鼠GFAP阳性细胞分析。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组(B1，B2)和Aβ1-42组(C1，C2)海马和皮质GFAP阳性细胞与空腺病毒载体组(A1，A2)相比明显减少。(D)海马和皮质GFAP阳性细胞所占面积百分比的定量分析，*和空腺病毒载体组相比P<0.05。比例尺代表 50μm

图4 Aβ和GFAP双染。(A)空腺病毒载体组，大量GFAP阳性细胞聚集在Aβ斑块周围和内部。(B)Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和(C)Aβ1-42组可见散在的GFAP阳性细胞。比例尺代表50μm

图5 三组小鼠免疫后脑组织淋巴细胞浸润检测。在三组中均未发现广泛的CD3，CD5，CD45阳性细胞。在血管周围和脑实质偶尔可以发现少量CD3阳性和CD5阳性细胞。比例尺代表100μm

2017-03-12；

2017-04-23

国家自然科学基金(No. 81371227) 作者单位：(1.大连医科大学附属第二医院神经内科，辽宁 大连 116027；2.中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 110001)

曹云鹏，E-mail：cypcmu@163.com

1003-2754(2017)05-0393-05

R749.1

A