基于纳米金Core—satellites等离子体耦合增强效应的汞离子光纤传感器的研究

贾朔+边超+佟建华+孙楫舟+夏善红

摘 要 以DNA杂交双链为联接， 构建纳米金颗粒Coresatellites结构并激发等离子体耦合增强效应，利用Hg2+可与DNA中胸腺嘧啶T形成THg2+T特异性结构，研制了用于检测水中Hg2+的局域等离子体共振（LSPR）光纤传感器。待测溶液中的Hg2+能够引起富含T的DNA单链折叠，抑制DNA杂交反应，降低等离子体耦合强度，改变LSPR谐振波长。通过检测谐振波长红移变化，实现对Hg2+浓度的定量检测。本方法检测Hg2+的线性范围为5～150 nmol/L， 检出限为3.4 nmol/L （3σ）。 Zn2+、Mg2+、Pb2+等重金属离子对Hg2+检测无明显干扰作用。实际水样中Hg2+加样回收率为94.2%～105.4%，相对标准偏差<4.8%。

关键词 局域等离子体共振； 纳米金Coresatellites结构； 脱氧核糖核酸； 汞离子； 光纤传感器

1 引 言

汞离子（Hg2+）具有高毒性和污染性，在水质检测中备受关注[1，2]。Hg2+常规检测方法主要包括冷原子荧光法、电感耦合等离子质谱法、冷原子吸收光谱法等[3～6]，这些方法虽然比较准确，但是存在设备昂贵、制样过程复杂、步骤繁琐等缺点。近年来，陆续报道了利用金属纳米颗粒作为传感元件，基于比色法、荧光法和表面增强拉曼光谱法用于Hg2+检测的研究报道[7～10]。其中，比色法检测灵敏度较低，荧光法需要标记，容易受到环境因素的干扰[11，12]， 表面增强拉曼光谱法对仪器设备要求高。因此，研发体积小、无标记、易于制备、灵敏度高的传感器具有重要的应用价值。

纳米贵金属颗粒受光激发能够产生局域等离子体共振效应（LSPR），基于LSPR的生化传感器无需标记、检测速度快、传感区域小[13]，已被用于Hg2+检测，但目前仍存在检测灵敏度较低的缺点[14～16]。研究表明，受光激发的两个贵金属颗粒接近时，其表面电磁场耦合产生等离子体增强效应[17，18]，并随距离存在红移和衰减特性[19]，该研究需要暗场显微镜和高精度光学系统，仅适用于实验室检测。Mucic等[20]提出了由一个核心纳米颗粒 （Auc）和多个外围纳米颗粒 （Aus）构成的Coresatellites 纳米结构，多个Aus使得耦合强度大幅提高，并适用于采用光谱仪检测，提高了实际应用能力。随后，其他研究者对该结构的材料组成、粒径尺寸等进行仿真优化[21～23]，并初步实现DNA、抗原抗体等的增敏检测[24，25]。

本研究以石英光纤纤芯为传感基底，以富含胸腺嘧啶（T）的互补DNA双链为联接，构建纳米金颗粒Coresatllites结构，并实现等离子体耦合增强效应。利用Hg2+能够形成THg2+T结构使DNA单链折叠[26，27]，减弱互补DNA杂交强度，降低等离子体耦合增强效应的特性，研制出一种体积小、结构简单、无标记、特异性、灵敏的检测Hg2+的光纤传感器。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

S4800扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）； QE65PRO型光纤光谱仪和DTMINI2GS宽带光源（美国Ocean Optics公司）； 传感光纤（直径600 μm，数值孔径为0.37，美国Thorlabs公司）； HC3018高速离心机（中科中佳公司）。磷酸盐缓冲液（PBS）、牛血清蛋白 （BSA）、聚烯丙基胺鹽酸盐（PAH）、巯基己醇（MCH），三（2羧乙基）膦（TCEP），购于SigmaAldrich公司。不同粒径纳米金溶液（Gold nanoparticles colloids，美国Ted Pella公司）。重金属离子标样购于环保部标准样品研究所； 其它试剂购自北京试剂厂。所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。DNA序列由上海生物工程有限公司合成，如表1所示。

2.2 光纤传感器的制备

光纤经去除包层、端面抛光和清洗烘干后，浸入Piranha洗液（浓 H2SO4H2O2（30%），7∶3， V/V）中，65℃水浴1 h，使纤芯表面羟基化[28]； 浸入2 mg/mL

阳离子聚电解质PAH（1 mol/L NaCl）溶液中30 min，PAH通过静电作用吸附在纤芯表面； 浸入表面带负电的Auc溶液中1 h，Auc通过静电吸附形成自组装单层； 利用银镜反应在光纤端面形成银反光镜[29]； 将光纤浸入DNAp溶液中12 h，使巯基化DNAp通过AuS键固定在Auc表面； 浸入1 mmol/L MCH溶液中自组装2 h； 将光纤浸入BSA（2 mg/mL，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）溶液中，封闭PAH表面吸附位点，减少非特异性吸附。

2.3 DNAT在液相Aus表面的修饰

取粒径20 nm 的Aus溶液，与DNAT以摩尔比1∶200混合，振荡24 h。加入TAE和NaCl老化，继续振荡24 h， 9000 r/min离心15 min，将沉淀物分散到40 mmol/L TrisHCl （pH 6.8， 0.1 mol/L NaCl）溶液中，获得DNAT修饰Aus（DNATAus）溶液。

2.4 Hg2+检测

将Hg2+标样稀释为0～1000 nmol/L待测溶液。按2.2节制备的光纤传感器，浸入Hg2+的TrisHCl溶液中30 min，用TrisHCl 缓冲液和去离子水清洗，吹干，室温下置于DNATAus溶液中1 h，并检测LSPR光谱谐振波长移动量（Δλp），通过加权质心算法（Weighted centroid algorithm）计算λp位置[30]。

3 结果和讨论

3.1 实验原理

如图1所示，光纤光在纤芯中以全反射方式传输，并在纤芯和周围媒介的固液界面产生倏逝波，倏逝波透过纤芯表面进入周围媒介激发Auc单层产生LSPR效应并返回纤芯，经光纤端面银反光镜反射，进入光纤光谱仪获得LSPR光谱。Auc表面DNAp与液相Aus表面DNAT发生杂交反应，使Aus结合在Auc表面，形成Coresatellites结构并激发等离子体耦合效应，导致λp红移。由于Hg2+能与T形成THg2+T结构，Hg2+存在时，DNAp通过THg2+T形成发卡结构，降低杂交反应强度，造成Aus结合量减少，降低Δλp。通过计算Δλp，实现对Hg2+浓度的定量检测。

3.2 Auc粒徑优化

取粒径40、60 和80 nm的金颗粒作为Auc，按2.2节制备由不同Auc修饰的光纤传感器，并在表面固定DNAp，浸入DNATAus溶液检测Δλp变化情况。如图2A所示，80 nm Auc修饰光纤传感器产生的Δλp最大，故选择80 nm作为Auc。图2B和2C分别是80 nm 单层Auc和结合Aus形成Coresatellites结构后的SEM图。

3.3 Auc表面DNAp的密度优化

Auc表面DNAp的密度是影响检测灵敏度的重要因素。采用不同浓度DNAp溶液对光纤表面Auc进行修饰，测试了光纤在DNATAus溶液中Δλp及对Hg2+的响应。如图3A所示，曲线a为不同光纤的初始λp位置； 曲线b显示不同浓度DNAp溶液修饰的光纤在DNATAus溶液中的λp随DNAp浓度的增加而增大； 当修饰DNAp浓度大于 150 nmol/L时，λp波长位置趋于稳定，表明此时Auc表面结合Aus已经趋于饱和。不同浓度DNAp溶液修饰的光纤用于检测50 nmol/L Hg2+，由曲线c可见，随DNAp浓度增加，λp逐渐增大； 图3B表明，Δλp先增大后减少； 在DNAp为200 nmol/L时Δλp达最大值，之后随DNAp浓度的增加而减小。这可能是当DNAp密度增加到一定量时，DNAp对Hg2+的结合能力达到最大； 继续增大DNAp浓度，受空间位阻的影响，DNAp对Hg2+结合量下降，降低了Δλp。 因此本研究采用200 nmol/L DNAp进行Auc表面修饰。

3.4 传感器对Hg2+的检测性能

采用本传感器检测不同浓度Hg2+的标准溶液。如图4所示，LSPR光谱的Δλp随着Hg2+浓度增高而降低，当Hg2+浓度高于150 nmol/L时，Δλp趋于稳定，这是因为通过THg2+T作用形成的发卡结构探针DNA开始逐渐趋于饱和。采用本方法检测Hg2+线性范围为5～150 nmol/L，线性方程为y=0.372x+94.143， 检出限为3.4 nmol/L （3σ）。

每次测量后，将本光纤传感器浸入95℃去离子水中10 min，使DNAp和DNAT解链，实现传感器的再生。以再生6次后的传感器检测100 nmol/L Hg2+，响应值的相对标准偏差（RSD）为3.9%，表明本传感器具有良好的可重复使用性，至少可重复使用6次。取6支光纤传感器检测50 nmol/L Hg2+。每支传感器重复测量3次的RSD为1.5%～3.1%； 6支传感器测量平均值的RSD为4.9%，表明此传感器具有良好的制备重现性。

本检测方法与文献报道的Hg2+检测方法，如比色法、荧光法、拉曼光谱法、电化学、石英晶振微天平等方法[31～35]相比，具有无需标记、体积小、易于集成的优点。

3.5 实际水样分析

取清华大学校内荷塘水样，静置过滤后去除悬浮物，利用谱尼公司原子荧光法进行水中Hg2+含量检测，结果表明，水样中未检测出Hg2+。利用标准加入法在实际水样中分别加入不同浓度Hg2+，测定加标回收率。结果如表2所示，回收率为94.2%～105.4%，RSD<4.8%，表明本方法适用于环境水样中Hg2+检测。

4 结 论

基于石英光纤基底，以互补DNA杂交做联接，构建纳米金Coresatellites结构，利用Hg2+对杂交反应的抑制作用构建了一种新型Hg2+检测的光纤传感器，Hg2+检测线性范围5～150 nmol/L，检出限3.4 nmol/L。此传感器微型便携， 具有良好的应用潜力。

References

1 Lin Y， Vogt R， Larssen T. Environ. Toxicol. Chem.， 2012， 31（11）： 2431-2444

2 Li G H， Feng X B， Li Z G， Qiu G L， Shang L H. Sci. Total Environ.， 2010， 408（20）： 4607-4612

3 Gil S， Lavilla I， Bendicho C. Anal. Chem.， 2006， 78（17）： 6260-6264

4 Yu L， Yan X. At. Spectrosc.， 2004， 25： 145-153

5 Bloxham M J， Hill S J， Worsfold P J. J. Anal. At. Spectrom.， 1996， 11（7）： 511-514

6 WANG Shuai， WANG Peng， WANG XiHe， GAO JiHui， ZHANG ZhiGuo， WU ShaoHua. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2009， 29（8）： 2262-2264

王 帅， 王 鹏， 汪细河， 高继慧， 张治国， 吴少华. 光谱学与光谱分析， 2009， 29（8）： 2262-2264

7 Jin L H， Han C S. Sens. Actuators B， 2014， 195（5）： 239-245

8 Han A， Liu X， Prestwich G D， Zang L. Sens. Actuators B， 2014， 198（198）： 274-277

9 Fu S， Guo X， Wang H， Yang H F. Sens. Actuators B， 2014， 199（4）： 108-114

10 Chemnasiri W， Hernandez F E. Sens. Actuators B， 2012， 173（10）： 322-328

11 Wang R Y， Zhou X H， Shi H C， Luo Y. Biosens. Bioelectron.， 2016， 78： 418-422

12 Long F， Gao C， Shi H C， He M， Zhu A N， Klibanov A M， Gu A Z. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26（10）： 4018-4023

13 Mayer K M， Hafner J H. Chem. Rev.， 2011， 111： 3828-3857

14 Heider E C， Trieu K， Moore A F T， Campiglia A D. Talanta， 2012， 99： 180-185

15 Zhao Q， Chen S N， Huang H W， Liu F P， Xie Y T. Anal. Lett.， 2014， 47： 295-308

16 RitheshRaj D， Prasanth S， Sudarsanakumar C. Opt. Commun.， 2016， 367： 102-107

17 Xu H X， Kall M. Phys. Rev. Lett.， 2002， 89： 24802

18 Su K H， Wei Q H， Zhang X. Nano Lett.， 2003， 3（8）： 1087-1090

19 Sonnichsen C， Reinhard B M， Liphardt J， Alivisatos A P. Nat. Biotechnol.， 2005， 23（6）： 741-745

20 Mucic R C， Storhoff J J， Mirkin C A， Letsinger R L. J. Am. Chem. Soc.， 1998， 120： 12674-12675

21 Sebba D S， Mock J J， Smith D R， LaBean T H， Lazarides A A. Nano Lett.， 2008， 8（7）： 1803-1808

22 Ruan Q F， Shao L， Shu Y W， Wang J F， Wu H K. Adv. Opt. Mater.， 2014， 2： 65-73

23 Ode K， Honjo M， Takashima Y， Tsuruoka T， Akamatsu K. ACS Appl. Mater. Inter.， 2016， 8： 20522-20526

24 Zhang T T， Li H， Hou S W， Dong Y Q， Pang G S， Zhang Y W. ACS Appl. Mater. Inter.， 2015， 7： 27131-27139

25 Hall W P， Ngatia S N， Van Duyne R P. J. Phys. Chem. C.， 2011， 115： 1410-1414

26 Ono A， Togashi H. Angew. Chem. Int. Ed.， 2004， 43： 4300-4302

27 Ono A，Torigoe H， Tanaka Y， Okamoto I. Chem. Soc. Rev.， 2011， 40： 5855-5866

28 Lin H Y， Huang C H，Chau L K. Biosens. Bioelectron.， 2014， 51： 371-378

29 Cao J， Galbraith E K， Sun T， Grattan K T V. IEEE SENS J.， 2012， 12： 2355-2361

30 Nenninger G G， Piliarik M， Homola J. Meas. Sci. Technol.， 2002， 13： 2038-2046

31 Chen G H， Chen W Y， Chen C F. Anal. Chem.， 2014， 86（14）： 6843-6849

32 Xu L G， Yin H H， Ma W， Kuang H. Biosens. Bioelectron.， 2015， 67： 472-476

33 Zhang J R， Huang W T，Zeng A L， Luo H Q， Li N B. Biosens. Bioelectron.， 2015， 64： 597-604

34 Zhang Y， Zhao H， Wu Z J，Xue Y， Zhang X F， He Y J， Li X J， Yuan Z B. Biosens. Bioelectron.， 2013， 48： 180-187

35 MO ZhiHong， YANG LinLing， YANG XiaoChao， CHEN ZiFeng. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（7）： 1033-1036

莫志宏， 楊琳玲， 杨小超， 陈自锋. 分析化学， 2009， 37（7）： 1033-1036

Abstract Based on the plasmon coupling effect in gold nanoparticles coresatellite nanostructures linked by thymine（T）rich DNA hybridization and the specific Hg2+mediated THg2+T base pair， a novel localized surface plasmon resonance （LSPR） optical fiber sensor was proposed and developed for Hg2+ detection in water. The Hg2+induced conformational change in Trich DNA sequence inhibited the DNA hybridization reaction， weakened the plasmon coupling effect and leaded to the change of LSPR resonance wavelength. The concentration of Hg2+ was quantitatively determined by the resonance wavelength redshift. The linear range of Hg2+ detection was about 5-150 nmol/L with LOD about 3.4 nmol/L. The specificity of the sensor was proved great by evaluating the response to other heavy metal ions such as Zn2+， Mg2+， Pb2+ and so on. This sensor was applied in environmental water detection by standard addition method，with the RSD less than 4.8% and recoveries of 94.2%-105.4%.

Keywords Localized surface plasmon resonance； Gold nanoparticles coresatellites structure； Deoxyribonucleic acid； Mercury ion ； Optical fiber sensor

（Received 25 October 2016； accepted 12 February 2017）

This work was supported by the Major State Basic Research Development Program （No.2015CB352100） and the National Natural Science Foundation of China （No.61501100）.