百令胶囊影响糖尿病肾病大鼠Caveolin-1蛋白表达机制探讨

韩 坤，郑亚萍

漯河医学高等专科学校生理教研室(河南 漯河 462002)

百令胶囊影响糖尿病肾病大鼠Caveolin-1蛋白表达机制探讨

韩 坤，郑亚萍

漯河医学高等专科学校生理教研室(河南 漯河 462002)

目的 探讨百令胶囊影响糖尿病肾病大鼠Caveolin-1蛋白表达机制。方法 30只SD大鼠，随机分为对照组(n=10) 、模型组(n=20)，模型组给予高脂饮食，喂养8周后，模型组大鼠应用链脲佐菌素(STZ)按40 mg/kg腹腔注射，对照组给予等体积枸橼酸钠；72 h测定两组大鼠随机血糖、体质量及24 h尿蛋白定量，将成模的 16只大鼠随机平分成2组：糖尿病肾病模型对照组(DN组，n=8)、百令胶囊组(n=8)，DN组及正常对照组均给予等量蒸馏水灌胃，百令胶囊组给予百令胶囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后测定各实验组大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及Caveolin-1蛋白表达量。结果 DN组Caveolin-1蛋白表达量较对照组升高了(112.8±2.76)%，差异有统计学意义(P<0.05)，而百令胶囊组较对照组升高了(61.2±4.31)%，较DN组下降了(51.6±3.48)%，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 百令胶囊可能通过调节Caveolin-1蛋白表达发挥对糖尿病肾病肾脏损伤的保护作用。

糖尿病肾病;一氧化氮合酶;百令胶囊; Caveoline-1

在中国，糖尿病患病率呈逐年上升趋势[1]，随着医疗技术的不断提高，糖尿病的急性并发症死亡率大大下降，但糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)做为糖尿病的慢性并发症，其发生率却明显增高，并严重影响患者的生活质量，其发病机制复杂，遗传、代谢、血流动力学等多种因素参与其中。其中，一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases, eNOS)调控血管通透性以及紧张度[2]，对糖尿病肾病的发生发展发挥重要作用。Caveolin-1是一种整合膜蛋白, 可溶性Caveolin-1主要存在于胞浆、线粒体以及分泌小泡。Caveolin-1多种存在形式的特性提示了它生物功能的多样性，在多条细胞传导信号中起重要作用[3]。eNOS对一氧化氮(NO)的调控主要通过结合Caveolin-1的CSD区域，并受其直接调节从而起负调控作用[4]。Caveolin-1 在DN中的报道较少。临床上百令胶囊在DN的治疗中效果明显，本实验主要研究Caveolin-1在DN中的作用及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物 30只成年SD大鼠(2月龄，体质量180～250 g)雄性，SPF级，由河南省实验动物中心提供(许可证号：SCXK豫2015-0011，合格证号：0008146)。于本实验室动物房分笼饲养，室温18～25 ℃，湿度40%～60%,白/夜12 h，自由饮食水。

1.2 主要仪器及试剂 链脲佐菌素(STZ)购自美国sigma 公司，百令胶囊购自杭州中美华东制药有限公司，血糖测定仪购自强生公司，尿微量白蛋白测定试剂盒购自北京北方生物技术研究所。兔Caveolin-1受体-抗购自美国Cell Signaling公司；小鼠Beta-actin单克隆抗体购自美国sigma公司，Blottinggradegoat Anti-Rabbit IgG(H+L)购自美国Bio-Rad公司，Blottinggrade Affinity Purifiedgoat Anti-Mouse IgG(H+L) 购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组和动物模型制作：30只SD大鼠，给予普通饲料喂养 1 周，随机分为对照组(n=10) 、模型组(n=20)，对照组继续给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料喂养，喂养8周后，禁食12 h，模型组大鼠应用STZ按40 mg/kg单次腹腔注射(STZ溶解在0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，配制成pH4.5液体使用)，对照组给予等体积0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液腹腔注射；观察72 h，接下来连续3 d测定两组大鼠随机血糖、体质量，留取24 h 尿液测定尿量，并检测24 h尿蛋白定量，随机血糖≥16.7 mmol/L；24 h尿量>原尿量150%；尿蛋白排泄>30 mg/24 h，则提示2型糖尿病肾病模型造模成功。模型组共有16只大鼠造模成功。

1.3.2 将造模成功的16只糖尿病肾病大鼠随机平分成2组：糖尿病肾病模型对照组(DN组，n=8)、百令胶囊组(n=8)，DN组及正常对照组均给予等量蒸馏水灌胃，百令胶囊组给予百令胶囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后测定各实验组大鼠血糖及24 h尿蛋白定量，然后处死各组大鼠，取肾脏组织并提取蛋白，利用蛋白质印迹法(western-blot)检测Caveolin-1蛋白在各组中的表达量。

2 结果

2.1 造模后两组基本数据比较 造模后，模型组大鼠体质量较前下降，随机血糖、24 h尿量、24 h尿蛋白均显著升高(P<0.05)，模型构建成功，见表1。

表1 造模后两组基本数据比较±s)

注：VS对照组，*：P<0.05

2.2 对照组、DN组、百令胶囊组血糖和24 h尿蛋白定量比较 与对照组比较，DN组、百令胶囊组随机血糖、24 h尿蛋白量均明显增加(P<0.05)；较DN组，百令胶囊组随机血糖无明显差异，24 h尿蛋白量下降有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 对照组、DN组、百令胶囊组血糖、24h尿蛋白定量比较

注：VS对照组，*P<0.05；VS DN组，▲P<0.05

2.3 对照组、DN组、百令胶囊组Caveolin-1蛋白表达量变化 DN组Caveolin-1蛋白表达量较对照组升高了(112.8±2.76)%，差异有统计学意义(P<0.05)，而百令胶囊组较对照组升高了(61.2±4.31)%，较DN组下降了(51.6±3.48)%，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：VS对照组，*P<0.05；VS DN组，▲P<0.05 图1 对照组、DN组、百令胶囊组Caveolin-1蛋白表达量变化

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病的常见慢性并发症之一，随着病情进展，多数患者会出现蛋白尿，严重时会因为肾衰竭而危及患者生命。

eNOS调控血管通透性以及紧张度[5]，在糖尿病肾病中的发生发展中有重大意义[6]。 它对NO的调控主要通过结合Caveolin-1的CSD区域，并受其直接调节从而起负调控作用。Caveolin-1的CSD可以和eNOS结合抑制NOS活性[7]； Akt诱导的eNOS磷酸化或者Ca2+/calmodulin的提高[8]可以使该抑制作用被阻断。在敲除Caveolin-1基因小鼠的研究表明，导致乙酰胆碱诱导性的血管舒张功能随着NOS的基础水平提高而加强，血管收缩功能因对α1-肾上腺素的反应而降低[9]，血管通透性随之增加，而eNOS的抑制剂L-NAME则可以发挥相反的作用。在Drab和Razanil的研究中，利用Caveolin-1基因敲除的小鼠[10]，通过离体大动脉血管收缩紧张度测量，发现在Caveolin-1的缺乏时，eNOS活性水平及血管弹性均降低，这一现象在动脉血管也已经被证实。该项研究进一步表明Caveolin-1在NO信号通路中发挥重要作用。因此，Caveolin-1可能在糖尿病的发生和发展过程中发挥重要作用。本实验研究结果表明：DN组Caveolin-1蛋白表达量较对照组升高了(112.8±2.76)%，差异有统计学意义，提示Caveolin-1参与糖尿病肾病发病，与上述Caveolin-1可能在糖尿病的发生和发展过程中发挥重要作用的结论基本符合。在本实验中，DN组Caveolin-1蛋白表达量较对照组升高，糖尿病肾病作为一种常见的糖尿病微小血管并发症，其引起的糖尿病血管病变，可能与其诱导血管内皮细胞上Caveolin-1的表达有关[11]。多项研究证实，Caveolin-1改善缺血部位的血液供应可能通过激活 Akt 信号通路，从而调节Akt/NO的生成而介导血管生成，本实验中DN组Caveolin-1蛋白表达量的升高提示在该过程中Caveolin-1发挥正性调节作用，与以往的研究中Caveolin-1多发挥负性调控作用的结论不一致，考虑Caveolin-1参与众多的信号传导途径，其负性调控作用并非在所有的信号转导途径适用[12]，同时，Caveolin-1 在血管形成中的具体功能本身仍存在争议，有研究推测在高血糖状况下，Caveolin-1的促进缺血组织中的血管形成的作用只有在Caveolin-1表达水平达到一定程度才能发挥，其详细机制仍有待进一步研究[13]。

在糖尿病肾病的治疗过程中，控制尿蛋白和降糖要同时进行[14]。百令胶囊是采用生物工程方法分离的冬虫夏草菌种经低温发酵精心研制而成的纯中药制剂，临床研究提示百令胶囊在抑制肾小管萎缩和肾间质纤维化、延缓慢性肾衰竭进展等多种肾脏疾病的治疗中起重要作用[15]，但是有关百令胶囊在DN治疗中的详细作用机制有待进一步研究。

本实验在糖尿病肾病大鼠成功造模的基础上，观察百令胶囊对DN大鼠血糖、蛋白尿的影响及Caveolin-1蛋白表达量的变化。研究结果表明：百令胶囊组较DN组随机血糖无明显差异，24 h尿蛋白量下降有统计学意义，Caveolin-1蛋白表达量百令胶囊组较对照组升高了(61.2±4.31)%，较DN组下降了(51.6±3.48)%，差异均有统计学意义，表明百令胶囊降低尿蛋白、改善肾功能有可能通过对Caveolin-1蛋白表达量的调控发挥作用。

综上，本研究提示百令胶囊可能通过调节Caveolin-1蛋白表达，从而对DN肾脏损伤起到一定的保护性作用，为临床治疗DN提供出新的理论依据，其治疗DN的具体机制及Caveolin-1蛋白在其他信号转导的作用尚有待于进一步研究。

[1] Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China [J].N Engl J Med,2010,362(12):1 090-1 101

[2] Nakagawa T,Sato W, Glushakova W,et al.Diabetic endothelial nitric oxide synthase knock out mice develops advanced diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(23):539-550

[3] Sonnino S,Prinetti A.Sphingolipids and membrane environments for cavcolin [J].FEBs Lett，2009,583(4):597-600

[4] 杨立会，黄娟娟，谢露，等.Caveolin-1在1型糖尿病大鼠肾脏中的改变及其意义[J].中国现代医药杂志，2013，15(4):1-3[5] 刘若海，王颖，吴文俊，等．Caveolin-1 在高盐饮食损伤糖尿病大鼠血管中的作用[J].中国病理生理杂志，2016，32(10):1 757-1 762

[6] Tabit CE,Chung WB,Hamburg NM,et al.Endothelial dysfunction in diabetes mellitus:molecular mechanisms and clinical implications[J].Rev Endocr Metab Dis,2010,11(1):61-74

[7] Otsu K,Toya Y,Oshikawa J,et al.Caveolin gene transfer improves glucose metabolism in diabetic mice [J].Physiol Cell Physiol,2010,298(3):450-456

[8] Garcia-Cardenag, Fan R,Stern DF,Liu J,and Sessa WC.Endothelial nitric oxide synthase is regulated by tyrosine phosphorylation and interacts with Caveolin-1.[J].Biol Chem 1996, 271(37):27 237-27 240

[9] Razani,B.Caveolin-1 null mice are viable but show evidence of hyperproliferative and vascular abnormalities[J].Biol.Chem.2001,276(37):38 121-38 138

[10] Razani B，Engelman JA，Wang XB，et a1．Caveolin-1 null mice are viable，but show evidence of hyper-proliferative and vascular abnormalities[J].Biol Chem,2001，276(41)：38 121-38 138．

[11] 张珊珊，袁罗勇，袁武磊.PI3K/AKT 通路在电针促进局灶脑缺血再灌注大鼠脑内血管再生中的作用[J].第三军医大学学报， 2010，32(23)：2 488-2 491

[12] 韩坤，王丹萍.慢性炎症痛过程脊髓背角Caveoline-1蛋白表达变化[J].湖北民族学院学报·医学版，2016，33(4)：4-6

[13] 熊国祚，刘辉．Caveoline-1促进糖尿病大鼠缺血下肢血管形成的作用及机制[J]．中国当代医药，2014，21(18):4-8

[14] Sari F,Sari R,Ozdem S,et al.S erum prolactin and macroprolactin levels in diabetic nephropathy [J].Clin Nephrol，2012,78(1)：33-39。

[15] 叶太生，周必发，张颖雯.百令胶囊对大鼠肾小球系膜细胞增殖、Ⅳ型胶原及TGF-β1mRNA表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2010，11(1):41-43

责任编辑：牟冬生

Effect of Bailing Capsule on Caveolin -1 Protein Expression of Diabetic Nephropathy Rats

Han Kun，Zheng Yaping

(TheDepartmentofPhysiology，LuoheMedicalColloge,Luohe462002,China)

Objective To investigate the effect of Bailing capsule on caveolin-1 protein expression of diabetic nephropathy rats. Methods 30 SD rats were randomly divided into control group (n=10) and model group (n=20).The model group was injected Streptozotocin (40 mg/kg) into abdominal cavity after 8 weeks'high-fat diet and the control group was given same dosage of sodium citrate. After 72 hours, the random blood glucose, weight and 24-hour urine protein were detected. The 16 model rats were randomly divided into diabetic nephropathy group(DN group, n=8)and Bailing capsule group(n=8). The DN group and control group were given the same amount of distilled water, and the bailing capsule group was given Bailing Capsule (2.5 g/kg·d-1). After 4 weeks, the random blood glucose, 24-hour urine protein and Caveolin-1 protein expression were observed. Results Compared with the control group, the Caveolin-1 protein expression of the DN group was up by (112.8±2.76) % and that of the Bailing capsule group was up by (61.2±4.31) %. Compared with the DN group, the Caveolin-1 protein expression of the Bailing capsule group decreased by 51.6±3.48%.The difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion The Bailing capsule may protect the renal injury of diabetic nephropathy by adjusting the Caveolin-1 protein expression.

diabetic nephropathy;endothelial nitric oxide synthases;bailing capsule;caveolin-1

韩坤，男，硕士，讲师，主要研究方向：神经生理和内分泌学。

R285

A

1008-8164(2017)02-0021-03

2017-03-31