“通体结香技术”所结人工沉香的质量评价

李浩洋，张宪臣，张小花，胡仪光，李 蓉＊

（1.中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中山528400； 2.中山市国林沉香科学研究所，中山528400）

“通体结香技术”所结人工沉香的质量评价

李浩洋1，张宪臣1，张小花2，胡仪光1，李 蓉1＊

（1.中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中山528400； 2.中山市国林沉香科学研究所，中山528400）

国产沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含树脂的木材，主要产于我国海南、广东等地，是我国传统的名贵药材［1－2］。沉香味辛、苦，性微温，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，主治胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症状［3］。长期以来由于对沉香资源的过度采伐，白木香植物资源日渐枯竭，现被列为国家二级保护野生植物，并载入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ［4］。

在自然界中，只有当沉香属植物受到刺激或损伤时，才会产生沉香，结香过程往往需要几十年甚至上百年时间，远远不能满足市场临床用药需求。为此，人们研发了物理伤害结香法、接菌结香法、化学伤害结香法等多种人工结香技术来促进白木香树的结香［5］。文献［6］提出“白木香防御反应诱导结香假说”，发明了“通体结香技术”［7］，缩短了结香时间，提高了沉香产量，较好地解决了沉香产业化生产中面临的结香技术瓶颈，使产业化、规模化生产沉香变为现实，所结人工沉香可称为通体香沉香。因此，开展通体香沉香的质量评价，不仅可为通体香沉香的质量控制、质量评价提供理论依据，还能为通体结香产业提供有力的理论支撑。

目前，针对评价通体香沉香质量的研究主要集中在性状描述、显微鉴别、薄层鉴别、理化鉴别、浸出物含量、挥发油等方面［7－10］，而关于利用特征图谱、特征组分沉香四醇含量和特征参数评价通体香沉香质量的研究尚未见文献报道。特征图谱作为一种现代中药质量控制方法，已成为国内外广泛认可的中药质量控制模型［11－13］，特征组分沉香四醇则在沉香真伪鉴定中具有极其重要的作用［14］，而通体香沉香的特征参数可作为区别其他人工结香技术所结沉香的有效依据。本工作通过测定通体香沉香的特征图谱、沉香四醇和浸出物含量及特征参数，对通体香沉香的质量进行评价。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（DAD）；WNB22L4型水浴摇床；UA22MFD型超声波清洗机；DKN 612C型烘箱。

沉香四醇标准储备溶液：1 000mg·L－1，乙醇为介质，于4℃保存备用。使用时用乙醇稀释至所需质量浓度。

沉香四醇标准品（纯度为96.8%）；乙醇、乙腈、甲酸均为分析纯；试验用水均为超纯水（电阻率小于18.2μS·cm）。

1.2 色谱条件

Phenomenex C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温30℃；进样量10μL，流量0.7mL· min－1；检测波长252nm；流动相A为乙腈，B为0.1%（体积分数，下同）甲酸溶液。梯度洗脱程序：0～10min时，A由15%升至20%；10～19min时，A由20%升至23%；19～21min时，A由23%升至33%，保持18min；39～40min，A由33%升至35%，保持5min；45～46min时，A由35%跳转至95%，保持4min；50～51min，A由95%跳转至15%，保持9min。

1.3 试验方法

1.3.1 特征图谱和沉香四醇测定法

称取沉香样品（过0.35mm筛）0.200 0g，置于具塞锥形瓶中，加入乙醇10mL，称定质量，浸泡0.5h，超声（功率250W，频率40kHz）1h，放冷，再称定质量，用乙醇补足损失的质量，摇匀，静置，取上层清液，过0.22μm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜后，直接注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定。

1.3.2 醇溶性浸出物测定法

醇溶性浸出物含量按照2015年版《中国药典》四部中“浸出物测定法（醇溶性浸出物）”要求进行测定［15］。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

60.0 mg·L－1沉香四醇标准溶液的高效液相色谱图见图1，其保留时间为17.8min。

图1 沉香四醇标准溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC spectrum of agarotetrol standard solution

2.2 色谱条件的选择

试验考察了Thermo C18柱（100mm×2.1mm，3μm），Capcell C18柱（150mm×2.0mm，5μm），Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5μm）等色谱柱对沉香提取液的色谱峰分离的影响。结果发现，Phenomenex C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）对沉香提取液的色谱峰分离效果较好。

试验对流动相进行了选择，最初用乙腈－20mmol乙酸胺溶液作为流动相，提取液中色谱峰分离效果较好，但是有个别色谱峰达不到基线分离；选择乙腈－0.1%甲酸溶液为流动相时，分离效果有显著改善，经试验选择乙腈－0.1%甲酸溶液为流动相，采用1.2节中梯度洗脱条件，可实现各目标物质的有效分离，各峰峰形尖锐，峰对称性好。

2.3 标准曲线和检出限

按色谱条件对20.0，40.0，60.0，100.0，140.0，200.0mg·L－1沉香四醇标准溶液系列进行测定。以沉香四醇的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为y＝36.11 x－22.20，相关系数为0.999 8。

对低质量浓度沉香四醇标准溶液进行测定，以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N）为0.05mg· L－1，以10倍信噪比计算测定下限（10S／N）为0.8mg·L－1。

2.4 精密度和回收试验

平行称取通体香沉香样品7份，按试验方法进行测定，所测结果的相对标准偏差（RSD）为3.0%，表明方法精密度较好。

平行称取通体香沉香样品9份，分别进行高、中、低等3个浓度水平的加标回收试验，结果见表1。

表1 精密度和回收试验（n＝9）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：加标回收率在93.3%～120%之间，表明方法符合沉香四醇的测定要求。

2.5 特征图谱

按试验方法对沉香样品进行测定，记录其特征图谱，结果见图2。

图2 对照品和10批样品的HPLC特征图谱Fig.2 HPLC characteristic spectra of reference substance and 10batches of samples

由图2可知：对照品特征图谱S0中呈现6个特征峰，与2015年版《中国药典》中的沉香对照特征图谱整体相似，表明试验采用的天然沉香对照品满足药典中的要求。供试品图谱S1～S10中6个特征峰与对照品特征谱图S0一一对应，其中峰1的保留时间约为17.8min，与天然沉香对照品S0中峰1的保留时间基本一致，说明通体香沉香与天然沉香具有相似的化学成分。

2.6 沉香四醇的测定

取通体香沉香样品和天然沉香对照品，按试验方法进行测定，其结果见表2。

由表2可知：通体香沉香样品中沉香四醇的质量分数在0.12%～0.39%之间，符合2015年版《中国药典》中“沉香”项规定的0.10%的要求。

2.7 醇溶性浸出物的测定

取通体香沉香样品和天然沉香对照品各2份，按试验方法进行测定，其结果见表2。

由表2可知：通体香沉香样品中醇溶性浸出物的质量分数在10.0%～31.7%之间，符合2015年版《中国药典》中“沉香”项规定的10.0%的要求。

2.8 特征参数的确定

在对液相色谱特征图谱的研究中发现了6个特征峰，并通过对照品确认峰1为沉香四醇的特征峰，是鉴定沉香真伪的特征组分，而醇溶性浸出物则代表沉香中总的有效成分，二者的含量不仅代表沉香的本身特性，而且与结香技术息息相关，故将二者比值定义为特定结香技术所产沉香的特征参数，以K表示。“通体结香技术”的结香过程发生在白木香树内部，相对于其他结香方式其结香过程受外界因素影响较小，因此，所结人工沉香的K值相对稳定，其结果见表2。

表2 沉香四醇、浸出物和特征参数的测定结果Tab.2 Determination results of Agarotetrol，extracts and characteristic parameters

10批“通体结香技术”所结人工沉香K值的结果表明，通体香沉香样品的K值相对稳定，均在（1.3±0.1）×10－2范围内，而天然沉香对照品的K值测定结果为1.52×10－2。此K值可作为“通体结香技术”所结沉香的特征参数，以区别天然沉香或其他结香技术生产的人工沉香，也可利用K值和通体香沉香中浸出物含量粗略判断沉香四醇含量，缩短测定时间，提高测定效率，降低通体香沉香生产企业为评价沉香质量而购买试剂、标准品和检测仪器的费用，为通体结香产业的强大提供有力的理论依据。

本工作通过测定通体香沉香样品中液相色谱特征图谱、沉香四醇含量和醇溶性浸出物含量，对“通体结香技术”所结人工沉香进行了质量评价。“通体结香技术”所结人工沉香的质量符合2015年版《中国药典》中“沉香”项的规定，可以作为药品代替天然沉香入药。

［1］ 杨锦玲，梅文莉，余海谦，等.国产沉香HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2014，45（23）：3456－3461.

［2］ CHEN H Q，WEI J H，YANG J S，et al.Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus Aquilaria plants［J］.Chem Biodivers，2012，9（2）：236－250.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：186.

［4］ 梅文莉，左文健，杨德兰，等.沉香结香机理、人工结香及其化学成分研究进展［J］.热带作物学报，2013，34（12）：2513－2520.

［5］ 黄俊卿，魏建和，张争，等.沉香结香方法的历史记载、现代研究及通体结香技术［J］.中国中药杂志，2013，38（3）：302－306.

［6］ 张争，杨云，魏建和，等.白木香结香机制研究进展及其防御反应诱导结香假说［J］.中草药，2010，41（1）：156－159.

［7］ LIU Y Y，CHEN H Q，YANG Y，et al.Whole－tree agarwood－inducing technique：an efficient novel technique for producing high－quality agarwood in cultivated Aquilaria sinensis trees［J］.Molecules，2013，18（3）：3086－3106.

［8］ 赵艳艳，房志坚.“白木香通体造香技术”所结沉香质量评价及节基丙酮的含量测定［J］.广东药学院学报，2013，29（3）：253－257.

［9］ ZHANG X L，LIU Y Y，WEI J H，et al.Production of high－quality agarwood in Aquilaria sinensis trees via whole－tree agarwood－induction technology［J］.Chin Chem Lett，2012，23（6）：727－730.

［10］ 刘洋洋，杨云，魏建和，等.不同产地通体香沉香药材的质量分析［J］.中国现代中药，2014，16（3）：183－186.

［11］ 吴春艳，耿姝，伊晓娇，等.中药质量分析与评价的研究进展［J］.理化检验－化学分册，2015，51（7）：1035－1042.

［12］ GAO X X，XIE M R，LIU S F，et al.Chromatographic fingerprint analysis of metabolites in natural and artificial agarwood using gas chromatographymass spectrometry combined with chemometric methods［J］.J Chromatoger B，2014，967：264－273.

［13］ 林莉，麦曦，仲英，等.紫花地丁高效液相色谱法指纹图谱的建立和评价［J］.理化检验－化学分册，2011，47（12）：1461－1463.

［14］ MEI W L，YANG D L，WANG H，et al.Characterization and determination of 2－（2－Phenylethyl）chromones in agarwood by GC－MS［J］.Molecules，2013，18（10）：12324－12345.

［15］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典四部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：202.

O652.63

B

1001－4020（2017）04－0470－04

10.11973／lhjy－hx201704023

2016－04－05

中山市科技计划项目（2014A2FC241）；国家质检总局科技计划项目（2015IK052）

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