AQP1和AQP3在宫颈癌新辅助化疗前后的表达变化及意义

蒋珊珊 沈燕 李凯强 赵宇

●论 著

AQP1和AQP3在宫颈癌新辅助化疗前后的表达变化及意义

蒋珊珊 沈燕 李凯强 赵宇

目的 观察新辅助化疗前后宫颈癌组织中水通道蛋白1（AQP1）与水通道蛋白3（AQP3）表达的变化，探讨两者在宫颈癌新辅助化疗中的意义。方法 选择宫颈鳞癌患者30例，术前接受以顺铂为基础的有效新辅助化疗。化疗前和手术中分别取癌组织标本，应用RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法对水通道蛋白（AQPs）的mRNA、蛋白和组织分布进行检测。 结果化疗后AQP1和AQP3的mRNA表达量约为化疗前的3倍和2.7倍，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。AQP1和AQP3蛋白在宫颈癌组织中大量表达，在细胞膜和胞质中均有分布，化疗后表达量提高，以胞质更为明显。30例患者经过化疗后，其中19例完全缓解，11例部分缓解。完全缓解组患者化疗后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表达的增值虽然均大于部分缓解组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 结论 AQP1和AQP3在新辅助化疗后宫颈癌组织中的表达增加，增幅可能与化疗效果相关。

新辅助化疗 宫颈癌 水通道蛋白1 水通道蛋白3

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。据报道，每年全球约有53万新发宫颈癌患者，约27.5万人死于宫颈癌[1]。手术和放疗是宫颈癌的主要治疗方法，然而，尽管手术技巧、放疗设备和技术的不断改进，但宫颈癌的治疗效果并无根本性的提高，总的5年生存率仍徘徊在40%左右[2]。新辅助化疗的出现，为局部晚期宫颈癌患者争取了手术机会，并提高了放疗的敏感性。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一组跨膜转运水和小分子物质的特异通道蛋白质家族，在哺乳动物中共发现13种AQP亚型（AQP0～AQP12）[3]。近来的研究表明AQPs在肿瘤的发生、发展中起到重要的作用。AQPs在多种肿瘤组织中异常表达，已证实AQP1和AQP3在宫颈癌中表达显著[4]。卵巢癌、结直肠癌模型的研究均提示AQPs与抗肿瘤药物的效果具有相关性[5-6]。然而，关于AQPs与宫颈癌化疗药物疗效的相关研究尚未见报道。本研究拟探讨宫颈癌组织中AQP1与AQP3在新辅助化疗前后的表达变化，以及与化疗效果的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2014年1月至2016年1月在浙江省人民医院妇科手术治疗的宫颈鳞癌患者30例，年龄37～69岁。病例入选标准：（1）临床分期为Ⅰb2或Ⅱa2期；（2）手术病理确诊为鳞状细胞癌；（3）宫颈呈外生型生长，局部病灶≥4cm；（4）心肺功能良好，无化疗及手术禁忌症。所有患者均在术前接受2～3个周期的以顺铂为基础的化疗。经患者同意，化疗前和手术中分别取癌组织标本存入液氮罐中备用。

1.2 化疗效果评估 所有患者完成2～3个周期的化疗后2周，对于可测量实体瘤按照1979年WHO抗瘤药物客观疗效标准评价疗效：（1）完全缓解：全部可测量病灶完全消失持续4周；（2）部分缓解：病灶的最大直径与最大垂直横径乘积总和减少50%以上，持续至少4周：（3）稳定：各病灶最大直径与最大垂直横径乘积总和减少＜50%，或增大＜25%，持续至少4周且无新病灶出现；（4）进展：病灶的最大直径与最大垂直横径乘积总和增大＞25%，或出现新的病灶。（1）、（2）为有效，（3）、（4）为无效。

1.3 RT-PCR法检测AQP1、AQP3 mRNA的表达水平采用Trizol试剂盒法提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用TaqMan探针法，设计引物探针AQP1、AQP3、βactin，以β-actin为参照，荧光标记为FAM染料，在美国ABI公司的7500 PCR仪上进行操作。PCR循环参数为：95℃10min预变性；然后95℃15s，60℃1min，并检测荧光信号，共40个循环。每个样本重复3次，取平均值。反应结束后得出荧光反应曲线及CT值。

1.4 Western blot法检测AQP1、AQP3蛋白的表达水平提取总蛋白，利用一抗结合AQP1、AQP3，Western blot法检测化疗前后各指标的表达情况。Western blot过程：转印膜脱脂奶粉封闭后，一抗孵育24h，TBST洗膜，以HRP标记的二抗孵育。再洗膜后加入ECL底物显影、曝光，扫描胶片。

1.5 免疫组化法检测组织中AQP1、AQP3蛋白的分布组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片，使用免疫组化SP法检测。玻片脱蜡，微波修复，山羊血清室温孵育30min，一抗（AQP1、AQP3）孵育过夜，二抗室温孵育30min，辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15min，DAB显色，苏木素复染，淡氨水返蓝，树脂封片，光镜下观察。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以 表示，化疗前后AQP1和APQ3的表达水平比较采用配对秩和检验，不同化疗效果患者化疗前后AQP1和APQ3的表达水平变化比较采用两独立样本t检验。

2 结果

2.1 化疗后基本情况 30例患者经过化疗后，其中19例完全缓解，11例部分缓解，化疗效果均为有效。

2.2 化疗前后宫颈癌组织中AQP1和AQP3 mRNA的表达变化 RT-PCR法检测结果显示，化疗后AQP1 mRNA的表达量约为化疗前的3倍（3.19∶0.99），而化疗后AQP3 mRNA的表达量约为化疗前的2.7倍（2.70: 0.99），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

图1 化疗前后宫颈癌组织中AQP1与AQP3mRNA表达量的变化

2.3 化疗前后宫颈癌组织中AQP1和AQP3蛋白的表达变化 Western blot法检测结果显示化疗后宫颈癌组织中AQP1及AQP3蛋白的表达量较化疗前均有明显增加（均P＜0.05），见表1、图2-3。

表1 化疗前后宫颈癌组织中AQP1和AQP3蛋白的表达变化

图2 Western blot法检测化疗前后宫颈癌组织中AQP1和AQP3蛋白表达的电泳图

2.4 化疗前后AQP1和AQP3蛋白在宫颈癌组织中的分布 AQP1和AQP3蛋白在宫颈癌组织中大量表达，在细胞膜和胞质中均有分布。化疗后宫颈癌组织中AQP1和AQP3蛋白的表达量增加，以胞质更为明显，见图4。

图3 化疗前后宫颈癌组织中AQP1与AQP3蛋白表达量的变化

图4 化疗前后AQP1与AQP3蛋白的免疫组化结果（×200）

2.5 不同化疗效果组化疗前后AQP1和AQP3的表达变化 按照化疗效果分组，完全缓解组患者新辅助化疗后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表达的增值虽然均大于部分缓解组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 不同化疗效果组化疗前后AQP1和AQP3的表达变化

3 讨论

宫颈癌是威胁女性健康的最主要的妇科恶性肿瘤之一。新辅助化疗给晚期宫颈癌患者带来了希望，但是化疗效果的个体差异又使新辅助化疗的推广疑虑重重。近年来的研究筛选出了一些分子标记物[7-8]，这些分子标记物与宫颈癌化疗效果具有相关性。

AQPs广泛表达于机体的各部位，不仅在维持细胞内外的水平衡方面起到了重要的作用，而且在肿瘤生长、侵袭和转移的病理过程中也扮演了重要的角色。笔者前期研究发现，AQP1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈鳞癌组织间质的微血管内皮细胞上阳性表达，AQP1在CIN中的表达高于宫颈鳞癌和正常宫颈组织，在宫颈鳞癌中临床Ⅰ期的表达高于临床Ⅱ期；AQP3在正常宫颈组织、CIN、宫颈鳞癌的表达逐渐增高[4]。而AQP1在肿瘤血管内皮中的高表达，促进了肿瘤的生长浸润，其介导的高渗透性引起流体静力压的增高，导致缺氧而促进血管生成[9]。本研究探究了有效的新辅助化疗前后宫颈癌组织中AQP1和AQP3的变化，发现化疗后AQP1和AQP3的表达均明显上调，差异均有统计学意义，并且两种蛋白在细胞膜和胞质的分布发生变化，提示AQP1和AQP3可能在新辅助化疗治疗宫颈癌的机制中起到促进作用，其相关的机制有待进一步研究。

其他恶性肿瘤的相关研究表明AQPs与化疗效果有关。在卵巢癌体外实验研究中，AQPs阻滞剂和高渗状态可以增加卵巢癌细胞株SKOV3对顺铂的敏感性[5]。Shi等[6]利用结肠癌HT-29细胞为模型，AQP5的表达与化疗疗效正相关，并且推测是AQP5-P38 MAPK信号通路起作用。有关AQP1和AQP3与宫颈癌化疗疗效相关的研究尚罕见于报道。王晓云等[10]用免疫组化法检测了36例宫颈鳞癌化疗有效患者和54例无效患者，AQP1在敏感组宫颈癌中表达率为87.1%，高于无效组的表达率78.5%，但两者差异无统计学意义。本研究中，新辅助化疗后AQP1和AQP3 mRNA及蛋白水平的表达均明显增高。而完全缓解组患者新辅助化疗后AQP1、AQP3的mRNA和蛋白表达的增值大于部分缓解组，提示表达量的增幅可能与化疗效果具有相关性。但本研究上述结果比较差异均无统计学意义，考虑与本研究样本量较少，且缺少化疗无效病例有关。今后需扩大样本量，增加与化疗无效组的比较，来进一步探讨水通道蛋白在不同化疗效果类型上的表达差异。

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Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy

JIANG Shanshan,SHEN Yan，LI Kaiqiang,et al.Department of Gynecology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Neoadjuvant chemotherapy Cervical cancerAQP1 AQP3

2017-02-16）

（本文编辑:陈丽）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.10.2017-295

浙江省医药卫生计划项目（2015KYB015）；浙江省自然科学基金项目（LQ17H160017）

310014 杭州，浙江省人民医院妇科（蒋珊珊、沈燕），输血科（李凯强）；温州医科大学附属第二医院妇产科（赵宇）

赵宇，E-mail：894867055@qq.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-3(AQP3)in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy. Methods Thirty patients with cervical cancer were enrolled in the study.Effective neoadjuvant chemotherapy with cis-platinum was given in all cases before surgery.Tumor specimens were obtained before chemotherapy and during surgery.The expression of AQP1 and AQP3 mRNA and protein was determined by RT-PCR,Western blot and immunohistochemistry,respectively.Results The mRNA expression of AQP1 and AQP3 increased 3 and 2.7 times after chemotherapy,respectively.The AQP1 and AQP3 proteins were expressed abundantly in both cytomembrane and cytoplasm of cancer tissue;and the protein expression increased significantly after chemotherapy,especially in cytoplasm.Among the thirty patients,19 cases achieved complete remission(CR)and 11 cases partial remission(PR)after chemotherapy.There was no significant difference in AQP1 and AQP3 expression between CR cases and PR cases,although there was a trend of increasing expression in CR patients. Conclusion Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer is increased after neoadjuvant chemotherapy.