葡萄砧木及杂种的抗寒性鉴定

李妍琪，沈莉，简军全，张剑侠*

（西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室，陕西杨凌 712100）

葡萄砧木及杂种的抗寒性鉴定

李妍琪，沈莉，简军全，张剑侠*

（西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室，陕西杨凌 712100）

以葡萄砧木4个杂交组合河岸葡萄(♀)（V. riparia）×左山75097（V. amurensis）、泰山-11（V. amurensis）×河岸-2（V. riparia Mcadams）、泰山-11（V. amurensis）×Constantia（V. rupestris）、5BB（V. berlandieri × V. riparia）×黑龙江实生（V. amurensis）的亲本及其81株F1代杂种为试验材料，通过人工低温胁迫处理一年生休眠枝条，测定相对电导率、可溶性蛋白、脯氨酸及可溶性糖等4项生理指标，利用隶属函数法综合评价了各株系的抗寒性。结果表明：4个杂交组合的后代抗寒性出现了分离，总体上介于双亲之间，但也存在有超高亲或超低亲现象，表现为多基因控制的数量性状遗传特点，且抗寒性遗传倾向于抗性弱的方向。本研究并筛选出高抗和抗寒杂种，以期用于抗寒砧木新品种选育。

葡萄；砧木；杂种；抗寒性；鉴定

葡萄（Vitis vinifera L.）为葡萄科葡萄属藤本植物，在世界果树生产中占有重要位置。我国广阔的西北地区光照充足、昼夜温差大，非常有利于优质葡萄生产，但是这些地区冬季气候寒冷对葡萄的种植面积、产量、品质以及经济效益造成了负面的影响[1]。冬季低温带来的冻害，轻则造成枝蔓失去活力、减产，重则会导致枝蔓脱水致死、根系变褐失去吸水能力[2]。目前，大多数葡萄产区采用传统的埋土或烟熏等方式进行冬季葡萄园防寒，浪费了大量的人力、物力[3]。也有研究表明，采用不同覆盖方式或用喷淋系统对葡萄园霜冻进行防御效果较明显[4-5]，但是大面积推广应用较为困难。利用葡萄抗寒砧木进行嫁接栽培，可以提高葡萄冬季抗寒能力，减少埋土、降低生产成本[6]；还可以提高产量、改善果实品质[7]。

我国拥有丰富的野生葡萄资源，其中山葡萄（Vitis amurensis）是葡萄属中最抗寒的种，可耐-40 ℃的低温，是宝贵的抗寒种质资源[8]。利用我国特有的野生山葡萄与北美洲野生葡萄或砧木品种进行杂交，将中国野生山葡萄的抗寒基因与北美洲野生种的抗性基因结合在一起，以期培育抗寒甚至多抗性砧木新品种。而杂交育种过程中，对杂交后代抗寒性鉴定与筛选是一项非常必要的工作[9]。然而，植物的抗寒性是一个复杂的生理生化过程，仅靠单一指标评价不能够客观准确的反映其抗寒能力，因此许多研究采用隶属函数法综合评价抗寒性[10-13]。

本研究是在本课题组对葡萄种质资源以及砧木品种抗寒性综合评价的基础上[14-15]，对砧木抗寒育种中获得的杂种后代一年生枝条采用人工低温胁迫处理，测定相关生理指标并利用隶属函数法进行抗寒性综合评价，以期筛选抗寒性强的杂种单株，为选育抗寒砧木新品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为西北农林科技大学葡萄种质资源圃中保存的4个砧木育种杂交组合：河岸葡萄（♀）×山葡萄左山75097、山葡萄泰山-11×河岸-2、山葡萄泰山-11×沙地葡萄Constantia、5BB×山葡萄黑龙江实生，冬季取杂交亲本及其杂交后代的一年生枝条。以山葡萄株系“左山75097”为抗寒对照（CK1），欧洲葡萄品种“红地球”为不抗寒对照（CK2）。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的准备

2016年11月26日采集粗细均匀、长势一致的一年生休眠枝条并进行沙藏，2周后取出枝条（每株系取3～4根），用蒸馏水洗净并擦干，放入密封袋，4 ℃保存。

1.2.2 最佳处理温度的选择

参照前期本课题组研究获得的最佳冷冻处理温度-24 ℃进行温度处理[10,14-15]。对各杂交组合亲本及其后代进行抗寒指标的测定。温度处理过程如下：4 ℃冷藏8 h后放入0 ℃下保存8 h，然后放入-12 ℃保持8 h，再放入-18 ℃保持8 h，最后放入-24 ℃进行低温胁迫12 h。之后进行升温处理，即从-24 ℃取出放回-18 ℃下保持8 h，再放入-12 ℃保持8 h，随后放入0 ℃中8 h，最后置于4 ℃中保存。

1.3 测定指标

相对电导率的测定采用DDS-307型电导仪进行[16]，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，脯氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，可溶性糖含量的测定采用蒽酮显色法[17]。

1.4 数据分析

采用隶属函数法综合各项指标进行抗寒性评价[14]。其公式为：

式中：Uij表示i种类j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示所有种类j指标的最小值；Xjmax表示所有种类j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。

根据公式计算出隶属函数值，再用每株系的4个指标隶属函数值的平均数作为其平均隶属度。按照平均隶属度（Subordinate level，SL）将抗寒性分为5级：0.70～1.00为高抗（High resistance，HR），1级；0.60～0.69为抗（Resistance，R），2级；0.40～0.59为中抗（Middle resistance，MR），3级；0.30～0.39为低抗（Lower resistance，LR），4级；0～0.29为不抗（Susceptible，S），5级。

2 结果与分析

2.1 河岸葡萄（♀）×左山75097杂交后代的抗寒性表现

由表1可以看出，“河岸葡萄（♀）”ד左山75097”组合，亲本“河岸葡萄（♀）”表现为抗寒，“左山75097”表现为高抗，13株F1代出现了抗寒性分离，均表现为不同程度的抗寒，未出现不抗寒单株，后代平均隶属度分布在0.56～0.77，其中高抗寒2株，抗寒8株，中等抗寒3株；超过高值亲本“左山75097”（平均隶属度0.72）的有2株（HZ9、HZ10），低于低值亲本“河岸葡萄（♀）”（平均隶属度0.62）的有5株。

2.2 泰山-11×河岸-2杂交后代的抗寒性表现

抗寒性鉴定结果（表2）表明，“泰山-11”ד河岸-2”组合的亲本均表现为抗寒，13株F1代出现了抗寒性分离，均表现为不同程度的抗寒，未出现不抗寒单株，后代平均隶属度分布在0.51～0.68，其中抗寒9株，中等抗寒4株；超过高值亲本“泰山-11”（平均隶属度0.66）的有1株（TH6），低于低值亲本“河岸-2”（平均隶属度0.64）的有9株。

表1 河岸葡萄（♀）×左山75097杂交后代的抗寒性鉴定结果

表2 泰山-11×河岸-2杂交后代的抗寒性鉴定结果

2.3 泰山-11×Constantia杂交后代的抗寒性表现

对“泰山-11”דConstantia”杂交后代抗寒性鉴定结果（表3）表明，亲本“泰山-11”表现为抗寒、“Constantia”表现为中等抗寒，在38株F1代中出现了抗寒性分离，均表现为不同程度的抗寒，未出现不抗寒单株，后代平均隶属度分布在0.35～0.63，其中抗寒3株，中等抗寒31株，低抗寒4株；低于低值亲本“Constantia”（平均隶属度0.42）的有9株；大于亲中值（平均隶属度0.54）的有11株，占28.95%；等于亲中值的有2株，占5.26%；其余25株小于亲中值，占65.79%。

据此组合推测，葡萄抗寒性遗传可能为多基因控制的数量性状遗传，总体上偏向于抗寒性弱的方向。

2.4 5BB×黑龙江实生杂交后代的抗寒性表现

由表4可见，在“5BB”ד黑龙江实生”组合中，亲本“5BB”表现为中等抗寒、“黑龙江实生”表现为抗寒，在其17株F1代中出现了抗寒性分离，均表现为不同程度的抗寒，未出现不抗寒单株，后代平均隶属度分布在0.40～0.60，其中抗寒1株，中等抗寒16株；出现了9株杂种低于低值亲本“5BB”（平均隶属度0.52）。

表3 泰山-11×Constantia杂交后代的抗寒性鉴定结果

3 讨论

植物细胞膜对维持细胞内环境稳定起着非常重要的作用，植物细胞膜是一种选择性透过膜，在低温逆境条件下随着细胞质膜透性的增大，细胞内电解质及其他内含物将有不同程度的外渗，这些渗出物可用电导仪测定[18]，因此电导率可作为抗寒性鉴定的一项重要生理指标。植物体内的渗透调节物质主要包括可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸，在低温逆境下，为了维持细胞压力势稳定，植物体内渗透调节物质会大量积累。细胞内的可溶性糖，可以使细胞液浓度增加、冰点和渗透势降低，增强细胞保水能力，减轻低温对细胞的伤害，提高植物抗寒性[19]。可溶性蛋白质亲水性较强，可以增加细胞持水力，其含量随温度下降而增加，可以束缚更多水分，减少原生质结冰而造成伤害，提高植物的抗寒性[20]。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有较强的与水结合的能力，在低温逆境条件下，游离脯氨酸在植物体内大量积累，维持细胞内环境的相对稳定[21-22]。因此渗透调节物质的含量可以作为抗寒性鉴定的生理指标。

前人的研究表明，葡萄杂交后代抗寒隶属度呈连续分布，为多基因控制的数量性状[9-10]。本研究中，不同的杂交组合其后代抗寒性分离比例不同，在杂种株数较多的组合“泰山-11”דConstantia”中，后代抗寒性表现为数量性状遗传的特点，抗寒性遗传总体上偏向抗寒性弱的方向。在“河岸葡萄（♀）”ד左山75097”组合中，杂种HZ9、HZ10的平均隶属度分别为0.77、0.74，超过高值亲本“左山75097”（平均隶属度0.72）；在“泰山-11”ד河岸-2”组合中，杂种TH6的抗寒平均隶属度为0.68，高于高值亲本“泰山-11”（平均隶属度0.66）。“泰山-11”דConstantia”、“5BB”ד黑龙江实生”，均是抗寒与中等抗寒间的杂交，F1代均出现了抗性分离，多数杂种单株的抗寒性表现为中等抗寒，也出现有一定数量的杂种单株低于低值亲本，未出现超过高值亲本的杂种单株，这说明在今后的抗寒杂交育种组合选配时，应选择抗寒性强的砧木作亲本。

表4 5BB×黑龙江实生杂交后代的抗寒性鉴定结果

葡萄杂交后代抗寒性的研究已有报道[9-11]，本研究中采用电导法，并测定了可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖的含量，利用隶属函数法综合评价了葡萄砧木杂种的抗寒性，认为抗寒表现为数量性状遗传的特征且杂交组合后代的抗寒性偏向抗寒性弱的方向，与张文娥等[9]、张剑侠等[10]的结果相一致。下一步的工作是对筛选出的高抗寒单株进行扦插试验和嫁接亲和力试验，以期选育出抗寒砧木新品种。

[1] 王依, 靳娟, 罗强勇, 等. 葡萄低温胁迫与抗寒性相关因素研究进展[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2015(3): 61-66.

[2] 陈文朝, 闫凤岐, 王伟军, 等. 张家口地区葡萄冻害调查及预防措施[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2012(5): 42-45.

[3] 王琴, 王建友, 蒋江照, 等. 葡萄抗寒性研究进展[J]. 北方园艺, 2015(1): 179-181.

[4] 李鹏程, 郭绍杰, 李铭, 等. 葡萄专用覆盖材料对红地球葡萄安全越冬防寒效果综合评价[J]. 中国农学通报, 2011(6): 206-210.

[5] 于永明, 杨永平.喷淋防霜系统在葡萄园应用效果初报[J].甘肃农业, 2010(9): 92-94.

[6] 房玉林, 孙伟, 张振文, 等. 葡萄砧木的研究和利用概况[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2010(7): 74-80.

[7] 钟海霞, 艾尔买克·才卡斯木, 张付春, 等. 7个葡萄砧木根系的抗寒性研究[J]. 新疆农业科学, 2016, 53(3): 429-436.

[8] 贺普超. 葡萄学[M]. 中国农业出版社, 1994.

[9] 张文娥, 王飞, 潘学军. 葡萄种间杂交和自交后代抗寒性分析[J]. 西北农业学报, 2009, 18(4): 290-294.

[10] 张剑侠, 吴行昶, 杨亚州. 葡萄种间杂种的抗寒性评价[J]. 北方园艺, 2014(13): 1-6.

[11] 张文娥, 王飞, 潘学军. 应用隶属函数法综合评价葡萄种间抗寒性[J]. 果树学报, 2007, 24(6): 849-853.

[12] 玉苏甫·阿不力提甫, 阿依古丽·铁木儿, 帕提曼·阿布都热合曼, 等. 利用隶属函数法综合评价梨砧木抗寒性[J]. 中国农业大学学报, 2014, 19(3): 121-129.

[13] ZHANG B Q, YANG L T, LI Y R. Physiological and biochemical characteristics related to cold resistance in sugarcane [J]. Sugar Tech, 2015, 17(1): 49-58.

[14] ZHANG J X, WU X CH, NIU R X, et al. Cold-resistance evaluation in 25 wild grape species [J]. Vitis, 2012, 51(4): 153-160.

[15] 张剑侠, 吴行昶, 杨亚州, 等. 引进美国制汁葡萄品种抗寒性的综合评价[J]. 北方园艺, 2011(24): 1-4.

[16] 郝再彬, 苍晶, 徐仲. 植物生理实验[M]. 哈尔滨工业大学出版社, 2004.

[17] 李玲. 植物生理学模块实验指导[M]. 科学出版社, 2009.

[18] 曹建东, 陈佰鸿, 王利军, 等. 葡萄抗寒性生理指标筛选及其评价[J]. 西北植物学报, 2010, 30(11): 2232-2239.

[19] 卢精林, 李丹, 祁晓婷, 等. 低温胁迫对葡萄枝条抗寒性的影响[J]. 东北农业大学学报, 2015, 46(4): 36-43.

[20] 苏李维, 李胜, 马绍英, 等. 葡萄抗寒性综合评价方法的建立[J]. 草业学报, 2015, 24(3): 70-79.

[21] 张彪, 毛娟, 陈佰鸿, 等. 葡萄抗寒性鉴定及综合评价方法研究[J]. 甘肃农业大学学报, 2014, 49(6): 64-69.

[22] ZHANG Z K, ZHU Q G, HU M J, et al. Low-temperature conditioning induces chilling tolerance in stored mango fruit[J]. Food Chemistry, 2017, 219: 76-84.

Identification of cold resistance of grape rootstocks and their hybrids

LI Yanqi, SHEN Li, JIAN Junquan, ZHANG Jianxia*
(College of Horticulture, Northwest A & F University; State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas (Northwest A&F University); Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, Ministry of Agriculture, Yangling 712100 Shaanxi)

Using the grape rootstock parents and their 81 progenies from four cross combinations including V. Riparia (♀) (V. riparia) ×Zuoshan 75097(V. amurensis) , Taishan 11(V. amurensis) × V. riparia Mcadams (V. riparia) , Taishan-11 (V. amurensis) × Constantia(V. rupestris) and 5BB (V. berlandieri × V. riparia) ×Heilongjiang seedling (V. amurensis) as experimental materials, four physiological indicators including relative conductivity, soluble protein, proline and soluble sugar of annual dormant grapevine branches were measured by artifi cial low temperature stress treatment. Then, comprehensive evaluation of the cold resistance level of rootstock hybrids was carried out by subordinate function method. The results showed that the hybrids of four combinations presented cold resistance separation and the resistance level of hybrids between both parents in general, but there existed the ultrahigh or ultra-low parent phenomenon. The cold resistance of grapevine presented a quantitatively inherited character of polygene controlled and tended to weak resistance direction. The hybrids with high cold resistance selected will be used for further breeding new stock varieties.

grapevine; rootstock; hybridization; cold resistance; identifi cation

S663.1；S603.4

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.005

2017-03-11

国家科技支撑计划子课题（2013BAD02B04-06）

李妍琪（1993-），女，硕士生。E-mail: 876304785@qq.com

*通讯作者：张剑侠，教授，博士生导师，研究方向：葡萄种质资源与生物技术。E-mail: zhangjx666@126.com