成年辽宁绒山羊皮肤毛囊周期性发育不同时期FGF5mRNA的表达分析

王龙涛，葛晨霞，谷 博，孙丽敏，姜怀志

（吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118）

成年辽宁绒山羊皮肤毛囊周期性发育不同时期FGF5mRNA的表达分析

王龙涛，葛晨霞，谷 博，孙丽敏，姜怀志

（吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118）

成纤维细胞生长因子（FGF5）基因在次级毛囊的周期性发育过程中具有重要的调控作用。利用RT-PCR技术检测了FGF5基因mRNA在成年辽宁绒山羊皮肤毛囊不同时期（兴盛前期、兴盛期、退行期和休止期）的表达规律。结果表明：FGF5基因mRNA在不同时期的辽宁绒山羊皮肤组织中均有表达，表达量由高到低顺序依次为休止期、兴盛期、退行期和兴盛前期；在休止期表达量最高，兴盛前期表达量最低；其中休止期表达量与兴盛前期和退行期间差异均显著（P<0.05），兴盛前期与其余3个时期间也差异显著（P<0.05），但休止期与兴盛期、兴盛期与退行期间差异均不显著（P>0.05）。因此，FGF5基因表达可能控制着绒山羊的毛囊从兴盛期向退行期转换。

辽宁绒山羊；皮肤毛囊；FGF5基因；RT-PCR

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）作为一种能够诱导成纤维细胞生长的活性物质，在脊椎动物体内和无脊椎动物体内广泛存在。迄今为止，FGF家族一共被鉴定出23种［1］，FGF5是FGF家族的第5个成员。研究表明，FGF5是毛囊周期性活动的一种重要的生长因子，与毛囊的发育以及被毛生长有着密切关系［2－3］，是所有已知成纤维因子中控制毛囊从兴盛期向休眠期转换的最强有力因子。Suzuki等［4］、高爱琴等［5］、韩萨茹拉［6］研究认为，绒山羊被毛的长度与FGF5因子息息相关，FGF5可能是通过控制毛囊生长期的长短影响被毛的长度，从而达到抑制毛囊细胞的生长和分化的目的。目前，有关FGF5基因对辽宁绒山羊皮肤毛囊发育调控作用的研究报道还不够深入。本研究从处于不同周期性发育时期的成年辽宁绒山羊中采取皮肤组织，采用实时荧光定量PCR技术，对FGF5基因mRNA的相对表达量进行分析，旨在为揭示辽宁绒山羊皮肤绒毛发生的分子调节机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物的选择及皮肤样品采集

辽宁绒山羊来自吉林亚亨农牧科技发展有限公司。分别于毛囊年度周期性发育的不同时期，即3—5月（休止期）、6—8月（兴盛前期）、9—11月（兴盛期）以及12—翌年2月（退行期），选择年龄相同、体况相近的周岁辽宁绒山羊5只，在羊体右侧肩胛骨后沿背中线与腹中线的1/3体侧位置取1 cm2大小皮肤样本，放入液氮中快速冷冻保存。

1.2 主要仪器设备与试剂

总RNA提取试剂盒购自天根生物有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司；PCR Master Mix购自康为世纪公司；DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、反转录试剂盒、纯化试剂盒、6×DNA loading buffer购自Takala宝生物（大连）有限公司；低温离心机购自Sigma公司，电泳仪购自北京六一仪器公司，核算蛋白测定仪、PCR仪、凝胶成像系统购自Bio-rad公司，荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上公布的羊FGF5（HQ678172.1）和βactin mRNA（GQ372826.1）序列，用Premier 5.0软件分别设计VEGF和β-actin的引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 表达基因的引物序列信息

1.4 方法

根据试剂盒说明书进行总RNA提取以及反转录操作。以反转录所得 cDNA为模板，对 FGF5和 β-actin基因进行PCR扩增。PCR扩增反应条件：FGF5基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 5 min；β-actin基因，95℃ 2 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 5 min，4℃保存。对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。以纯化后的cDNA为模版，以β-actin基因作为内参基因，采用SYBR荧光染料方法，对目的基因FGF5进行相对定量PCR反应。PCR反应体系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，cDNA模版 2 μL，RNase Free H2O 6.4 μL，总体积 20 μL。PCR反应条件：95℃ 60 s；95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，40个循环。

1.5 统计分析

应用SPSS 18.0软件计算实时荧光定量PCR重复样品间Ct值及标准偏差；采用2－ΔΔCt法处理数据，分析基因相对表达差异量。所有数据均进行单因子方差分析，用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 辽宁绒山羊皮肤组织总RNA提取

由图1中可见，所提取的总RNA电泳条带清晰，并没有基因组DNA污染，完整性良好。用核酸蛋白测定仪对其纯度进行测定，所有样品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之间，符合后续试验对RNA质量的要求。

图1 总RNA电泳结果

2.2 PCR扩增目的片段

琼脂糖凝胶电泳（1%）检测FGF5基因目的片段的扩增情况，发现扩增得到的片段与目的基因基本相符，没有二聚体产生（图2）。

2.3 荧光定量PCR分析

2.3.1 标准曲线及扩增曲线 反应结束完成后，根据各扩增曲线得到的Ct值，制作标准曲线。由图3可见，标准曲线上的4个标准点都在一条直线上，拟合度高；PCR溶解曲线形成单峰，说明扩增特异性较好，可信度较高。

图2 FGF5和β-actin基因的PCR产物

2.3.2 qPCR检测 采用qPCR方法，检测不同时期的成年辽宁绒山羊皮肤毛囊组织中FGF5基因的表达量，并通过Ct值与标准曲线计算每个样品基因与相应内参基因的表达相对值（表2）。结果表明，FGF5基因mRNA在不同时期的辽宁绒山羊皮肤组织中均有表达，在休止期表达量达到最高峰，在兴盛前期表达量达到最低峰：其中表达量在休止期与兴盛前期和退行期间差异显著（P<0.05），兴盛前期与其余3个时期间也差异显著（P<0.05），休止期与兴盛期、兴盛期与退行期间差异均不显著（P>0.05）。

表2 FGF5荧光定量PCR定量结果

图3 FGF5基因的标准曲线及溶解曲线

3 讨论

FGF5与毛囊的发育有着密切的关系，是影响被毛生长最重要的生长因子。Hebert等［2］和Sundberg等［7］分别采用基因敲除等方法研究证实，FGF5与毛囊发育有着密切关系，是毛囊周期性活动以及被毛生长的一个极其重要的生长因子，是已知的调控毛囊发育的各种因子中控制毛囊从兴盛期向休眠期转换最强有力的因子。随后Housley等［8］、Drögemüller等［9］、李春笑等［10］在犬、猫和兔等动物的研究中证实，FGF5基因外显子突变与动物的产毛量相关联。刘海英等［11］和韩萨茹拉等［6］通过对FGF5基因在内蒙古绒山羊不同时期皮肤的表达证实，该基因可以在绒山羊皮肤毛囊发育周期中的各个时期表达，并且该基因突变位点仅与绒山羊的纤维长度和含绒率相关，而与绒纤维直径不相关。高爱琴等［5］研究表明，在内蒙古绒山羊毛囊的生长旺盛期和退行期FGF5基因均有表达。而何永新等［12］在太行黑山羊的研究中发现，兴盛期的FGF5基因mRNA表达量显著高于退行期。本研究发现，FGF5基因在不同时期的辽宁绒山羊皮肤组织中均有表达，并以兴盛期为最高。与上述相关研究报道相一致，说明FGF5主要控制着绒山羊的毛囊从兴盛期向退行期转换。

［1］ Souletl，Chevete，Lemaitreg，et al.FGFs and their receptors，in vitroand in vivo studies：newFGF receptor in the brain，FGF-1 in muscle，and the use of functional analogues of low-affinity heparin-binding growth factor receptors in tissue repair［J］.Mol Reprod Dev，1994，39-49.

［2］ Hebert J M，Rosenquist T，Martin G R.FGF5as a regulator of the hair growth cycle：Evidence from targeted and spontaneous mutations［J］. Cell，1994，78：1017-1025.

［3］ Petho-Schramm A，Muller H J，Paus R.FGF5and the murine hair cycle［J］.Arch Dermatol Res，1996，288（5/6）：264-266.

［4］ Suzuki S，Ota Y，Ozawa K，et al.Dual-mode regulation of hair growth cycle bytwoFGF5gene products［J］.J Invest Dermatol，2000，114（3）：456-463.

［5］ 高爱琴，李宁，李金泉，等.不同发育阶段绒山羊皮肤中FGF5基因mRNA表达的RT-PCR检测［J］.华北农学报，2008，23（1）：36-37.

［6］ 韩萨茹拉.成纤维生长因子5（FGF5）在绒山羊皮肤中表达及多态性分析［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2009.

［7］ Sundberg J P，Rourk M H，Boggess D，et al.Angora mouse mutation： altered hair cycle，follicular dystrophy，phenotypic maintenance of skin grafts，and changes in keratin expression［J］.Veterinary Pathology，1997，34（3）：171-179.

［8］ Housley D J，Venta P J.The long and the short of it：evidence that FGF5is a major determinant of canine‘hair’-itability［J］.Animal Genetics，2006，37（4）：309-315.

［9］ Drögemüller C，Rüfenacht S，Wichert B，et al.Mutations within the FGF5gene are associated with hair length in cats［J］.Animal Genetics，2007，38（3）：218-221.

［10］李春笑，蒋美山，陈仕毅，等.兔成纤维细胞生长因子（FGF5）基因SNP及其与产毛量的相关分析［J］.遗传，2008，30（7）：893-899.

［11］刘海英，杨桂芹，张薇，等.FGF5基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影响［J］.遗传，2009，31（2）：175-179.

［12］何永新，陈玉林，姜维，等.太行黑山羊FGF5基因CDs区的序列特征及其表达规律研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，39（12）：45-50.

Expression of FGF5mRNA in Hair Follicles of Adult Liaoning Cashmere Goats in Different Periods

WangLongtao，Ge Chenxia，JiangHuaizhi，et al
（College ofScience and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

FGF5plays an important role in the developmental processes of secondary follicle.Using RT-PCR technology,this study was conducted to detect the expression pattern of FGF5mRNA of adult Liaoning cashmere goats in different periods.The result showed that FGF5gene mRNA were expressed in skin tissue of Liaoning cashmere goats in different periods，while the expression levels，from high to low，were telogen，anagen，catagen and proanagen，respectively.The expression level reached a peak in telogen and reached minimum peak in proanagen.The expression level between telogen and proanagen，catagen had significantdifferences（P＜0.05），andthedifferencebetweenproanagenandtheanagenwas significant（P＜0.05）.

Liaoningcashmeregoat；hair follicle；skin；FGF5gene；RT-PCR

S827.2

A

2095-3887（2017）02-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.002

2017-03-28

国家“十一五”科技支撑计划项目（2009BADA5B03）；吉林省科技发展计划项目（20080212）

王龙涛（1975-），男，博士。

姜怀志（1968-），男，教授，博士，博士生导师，主要从事绵山羊遗传育种与种质资源创新研究工作。