鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

蔡笃雄，苏颖洁，汤净(海南医学院第一附属医院消化内科，海南海口570102)

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

蔡笃雄，苏颖洁，汤净(海南医学院第一附属医院消化内科，海南海口570102)

目的探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响。方法培养的胰腺癌SW1990细胞株，实验分为DMS组、PMA组和对照组，各组细胞接种于孔板中，每组设3个复孔，每个实验至少重复3次。DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS，50µmol/L)，PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，100 nmol/L)，对照组按常规培养，采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化，流式细胞术检测细胞凋亡，RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达，Western blot检测SPK1蛋白的表达。结果PMA组细胞的增殖活力[OD值：(1.37±0.03)，细胞克隆数目：(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01)，细胞克隆数目：(215.34±12.23)]显著增加，DMS组细胞的增殖活力[OD值：(0.65±0.02)，细胞克隆数目：(130.56±15.6)]较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降，DMS组细胞凋亡率[(31.7± 1.32)%]较对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA：(0.148±0.006)，蛋白：(0.182±0.044)]显著增加，而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关，SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡。

鞘鞍醇激酶-1；胰腺癌；增殖；凋亡

近年来，分子靶向治疗成为胰腺癌治疗研究中的热点，目前国内外许多学者都在探求基因水平的调控方法和寻找治疗的新靶点，以期在胰腺癌的治疗上取得突破[1]。近年研究证明鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是细胞增殖及存活的重要调控因子，SPK1信号途径与细胞的凋亡、增殖和迁移密切相关[2-3]。本研究旨在研究SPK1对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨SPK1是否可能成为胰腺癌分子靶向治疗的一个新型分子，为胰腺癌的基因治疗寻找新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人胰腺癌细胞株SWl990购自中国科学院上海生命科学研究院，佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)购自美国Sigma公司，N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)购自美国Sigma公司，四氮唑蓝(MTT)、DMEM完全培养基、1640培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖活力人胰腺癌SWl990细胞采用100 mL/L胎儿血清的DMEM完全培养基在5%CO2，37℃的培养箱培养，取对数生长期细胞，按实验分组分别加入100 nmol/L的PMA(PMA组)及50µmol/L的DMS(DMS组)，对照组的细胞用含100 mmol/L胎牛血清的培养基培养，每组设3个复孔，采用MTT法检测，所有步骤均参照试剂盒说明书进行,最后在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值(OD值)，反映细胞增殖活力。

1.2.2 克隆形成实验检测细胞增殖活性将各组细胞分别培养，收集各组对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度500个/mL，分于6个孔板，每组设3个复孔，培养10～14 d，最后观察克隆出现日期及生长情况，大于50个细胞的集落算一个克隆，计数每个孔的克隆数并拍照。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞技术检测细胞凋亡率取生长状态良好的对数生长期的细胞，接种于6个孔板，每组接种3孔，各组细胞经处理后采用0.25%胰酶消化单层细胞，800 r/min离心，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，离心弃上清，最后用1× annexin-binding buffer重悬细胞，将细胞密度调整为约1×106细胞/mL，取100µL体积为待测样本，加5µL Alexa Fluor®488 annexin V样本中。室温卵育细胞15 min后，加400µL 1×annexin-binding buffer，及1µL 100 μg/mL PI到待测细胞样本，混匀。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 PMA和DMS对SPK1 mRNA表达的影响各组细胞继续培养24 h，提取细胞总RNA，采用RT-PCR法；引物序列如下：SPKl：正义：5'-CCGACGAGGACTITGTGCTAGT-3'，反义：5'-GCCTGTCCC CCCAAAGCAIAGC-3'；GAPDH：正义：5'-AATCCCA TCACCATCTTCCA-3'，反义：5'-CCTGCTrCACCAC CTTCTTG-3'。PCR产物电泳后用凝胶成相仪扫描分析。以目的条带SPKl与GAPDH的灰度比值表示SPK1 mRNA的相对表达量。

1.2.5 PMA和DMS对SPK1蛋白表达的影响各组细胞培养24 h后提取总蛋白，采用Western blot检测SPK1蛋白的表达，所有步骤均参照试剂盒说明书进行，用Kodak摄像系统拍照。Image J软件分析蛋白的灰度值，以SPKl与β-actin的灰度比值表示SPKl蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 PMA和DMS对SWl990细胞增殖活力的影响对照组、PMA组及DMS组OD值分别为：(1.00± 0.01)、(1.37±0.03)和(0.65±0.02)，PMA组OD值明显高于对照组(t=3.75，P<0.05)，DMS组OD值明显低于对照组，差异均具有统计学意义(t=4.12，P<0.05)(表1，图1)。对照组、PMA组及DMS组克隆形成数目分别为：(215.34±12.23)、(292.45±10.68)、(130.56±15.6)，PMA组的克隆形成数目明显高于对照组(t=2.62，P< 0.05)，DMS组的克隆形成数目明显低于对照组，差异均有统计学意义(t=2.84，P<0.05)，见表1、图2。

2.2 PMA和DMS对SWl990细胞凋亡的影响对照组、PMA组、DMS组细胞凋亡率分别为(16.71± 1.53)%、(9.7±0.62)%和(31.7±1.32)%。PMA组细胞凋亡率明显低于对照组，差异有统计学意义(t=13.04，P< 0.01)，DMS细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(t=14.12，P<0.01)，见表1、图3。

2.3 各组SPK1 mRNA的表达对照组、PMA组及DMS组的SPK1 mRNA表达强度分别为(0.148± 0.006)，(0.202±0.013)，(0.112±0.022），PMA组SPK1 mRNA表达较对照组显著增强，差异有统计学意义(t= 5.46，P<0.05)，而DMS组SPK1 mRNA表达较对照组明显降低，差异有统计学意义(t=5.75，P<0.05)，见表1、图4。

图1 各组细胞的增殖活性与对照组比较，aP<0.05。

图2 各组细胞的克隆形成数目与对照组比较，aP<0.05。

图3 PMA和DMS对SWl990细胞凋亡的影响

表1 各组细胞OD值、细胞克隆形成数目、细胞凋亡率、SPK1/GADPH及SPK1/β-actin比较

表1 各组细胞OD值、细胞克隆形成数目、细胞凋亡率、SPK1/GADPH及SPK1/β-actin比较

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。

组别对照组PMA组DMS组OD值1.00±0.01 1.37±0.03a0.65±0.02a细胞克隆形成数目215.34±12.23 292.45±10.68a130.56±15.6a细胞凋亡率(%) 16.71±1.53 9.70±0.62b31.74±1.32bSPK1/GADPH 0.148±0.006 0.202±0.013a0.112±0.022aSPK1/β-actin 0.182±0.044 0.258±0.015a0.101±0.034a

图4 各组SPK1 mRNA的表达

2.4 各组SPK1蛋白的表达对照组、PMA组及DMS组SPK1蛋白表达强度分别为(0.182±0.044)、(0.258±0.015)、(0.101±0.034)，PMA组SPK1蛋白表达较对照组显著增强，差异有统计学意义(t=6.16，P< 0.05)，而DMS组SPK1蛋白表达较对照组明显降低，差异有统计学意义(t=-5.83，P<0.05)，见表1、图5。

图5 各组SPK1蛋白的表达

3 讨论

近年研究证明细胞膜鞘磷脂的衍生物包括神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)等多种代谢产物,在肿瘤发生发展过程中发挥着极为重要的作用。研究证实Cer是一种细胞增殖负调控因子，抑制细胞生长、促进细胞凋亡，而其转化生成的代谢物S1P则抑制细胞凋亡、促进细胞增殖[4]。鞘氨醇激酶(SPK)是细胞内合成S1P的主要限速酶，其中SPK1的作用最为关键。SPK1的活性受抑会导致细胞内Cer、Sph水平升高，S1P水平降低，导致细胞生长抑制或诱导凋亡的产生，Li等[5]研究发现应用SPK1抑制剂可抑制人胃癌细胞的生长并促进细胞的凋亡，因此，SPK1的表达及活性高低直接决定着细胞的命运，SPK1也是细胞增殖及存活的重要调控因子。

近年来，有关SPK1在肿瘤方面的研究越来越多，目前国内外研究主要集中在胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肝癌、白血病等方面[6-9]，但有关SPK1与胰腺癌的研究较少，Aoki等[10]研究发现SPK1的激活可通过促进S1P的生成从而促进胰腺癌细胞的腹膜转移。Gong等[11]研究发现应用SPK1抑制剂可通过促进神经酰胺的生成从而促进胰腺癌细胞的凋亡，Guillermet-Guibert等[12]研究发现，应用SPK1抑制剂可通过上调神经酰胺表达水平或降低SPK1活性而增加吉西他滨对胰腺癌细胞的化疗敏感性，因而提示SPK1可能成为一种肿瘤靶向治疗的新型分子。

本研究通过运用PMA和DMS来调节SPK1的活性和表达，研究SPK1对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响，发现PMA组细胞的增殖活力显著增加，细胞凋亡率明显下降，SPK1 mRNA及SPK1蛋白表达水平显著增加，DMS组细胞的增殖活力显著降低，细胞凋亡率明显升高，SPK1 mRNA及SPK1蛋白表达水平显著降低，表明激活SPK1能显著促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡，抑制SPK1显著抑制胰腺癌细胞的增殖并促进细胞的凋亡，SPK1可调控胰腺癌SWl990细胞的增殖和凋亡。

综上所述，SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关，SPK1的激活能显著促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡，而抑制SPK1显著抑制胰腺癌细胞的增殖并促进细胞的凋亡，通过调控SPK1活性可影响胰腺癌SWl990细胞的增殖和凋亡。因此，SPK1有可能成为胰腺癌分子靶向治疗的一个新型分子。

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[12]Guillermet-Guibert J,Davenne L,Pchejetski D,et al.Targeting the sphingolipid metabolism to defeat pancreatic cancer cell resistance to the chemotherapeutic gemictabine drug[J].Mol Cancer Ther,2009,8 (4):809-820.

Effect of sphingosine kinase 1 on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell line SW1990.

CAI Du-xiong,SU Ying-jie,TANG Jing.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of sphingosine kinase 1(SPK1)on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer line SW1990.MethodsCultured SW1990 cell were divided into three groups:PMA group, DMS group and the control group.The cells of each group were seeded in the orifice plate,with 3 wells in each group,at least 3 replicates for each experiment.The cells of the PMA group were treated with 100 nmol/L of phorbol 12-myristate13-acetate(PMA);the DMS group was treated with 50µmol/L N,N-dimethylsphingosine(DMS);while the control group was cultured routinely.After the treatment,cell proliferation was determined by MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)assay and colony formation assay,cell apoptosis was detected by flow cytometry,and mRNA and protein expression of SPK1 were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe cell viability in PMAgroup was the OD value of(1.37±0.03)and the number of cell clones of(292.45±10.68),which was significantly higher than the OD value of(1.00±0.01)and the number of cell clones of(215.34±12.23)in the control group(P< 0.05).The cell viability in DMS group was the OD value of(0.65±0.02)and the number of cell clones of(130.56±15.6), which was significantly higher than that in the control group(P<0.05).The apoptosis rate in PMA group was(9.7± 0.62)%,which was significantly lower than(16.71±1.53)%in the control group,and the apoptosis rate in DMS group was(31.7±1.32)%,which was significantly higher than that in the control group(P<0.01).The mRNA and protein expression of SPK1 in PMA group were respectively(0.202±0.013)and(0.258±0.015),which were significantly higher than(0.148±0.006)and(0.182±0.044)in the control group,and the mRNA and protein expression of SPK1 in DMS group were(0.112±0.022)and(0.101±0.034),which were significantly lower than those in the control group(P<0.05).ConclusionSPK1 is closely related to the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells.The activation of SPK1 can promote the proliferation of pancreatic cancer cells and inhibit the apoptosis.

Sphingosine kinase 1(SPK1);Pancreatic cancer;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.002

R735.9

A

1003—6350（2017）10—1552—04

2017-01-06)