连续色谱分级分离系统在金银花活性成分提取中的应用

郑乃仁 , 沈 杰, 楚占营, 张维冰, 邓玉林

连续色谱分级分离系统在金银花活性成分提取中的应用

郑乃仁 , 沈 杰2, 楚占营2, 张维冰2, 邓玉林1＊

（1.北京理工大学，北京，100081；2.华东理工大学，上海，200237）

采用连续色谱分级分离装置对金银花水提液中绿原酸和总黄酮实现连续分级分离，考察上样液pH值﹑上样体积﹑洗脱流速﹑洗脱中乙醇含量及pH值﹑洗脱流速﹑洗脱剂用量对分级效果的影响，最终采用717型阴离子交换树脂柱﹑AB-8型大孔吸附树脂柱和聚酰胺树脂柱将金银花水提液中的绿原酸和总黄酮进行分级分离，并对总黄酮进一步分离，最终绿原酸和总黄酮的得率分别为69.0%与64.5%，纯度分别为63.0%与90.3%。

连续分级装置；金银花；活性天然成分

金银花又名忍冬，是一种传统的中药材，具有较高的药用价值，常用于如身热﹑发疹等热性病症，效果显著[1]。现今，已有许多关于金银花活性成分的研究报告，普遍认为金银花中主要含有绿原酸等有机酸类﹑黄酮类等成分。这些成分是金银花香味和药用价值的主要的活性成分，具有抗菌杀毒和抗氧化的功效。

对金银花中有效成分的分级分离是时下金银花研究的重点和热点。近年来，采用吸附-分离材料分离纯化中草药提取液已越来越受到人们的重视，并已逐渐成为中草药活性成分分离纯化的主流方法。离子交换树脂[2]﹑大孔吸附树脂是较为理想的绿原酸吸附剂[3-5]，而总黄酮的分离纯化常用大孔吸附树脂和聚酰胺树脂[6-9]。

目前对于绿原酸和总黄酮的分离纯化多是分步进行的，缺少对复杂天然产物中这两种成分的一次性连续分级分离。本文采用一种新型的天然产物连续分级分离装置，对金银花水提液进行连续分级分离，以绿原酸和总黄酮吸附量﹑洗脱量为考察指标，考察了上样液pH﹑上样体积﹑洗脱流速﹑洗脱中乙醇含量及pH值﹑洗脱流速﹑洗脱剂用量等对整个分级分离过程的影响，并对各项参数进行优化，获得了新型天然产物连续分级分离装置对金银花水提液分级分离的优化工艺参数。

1 试剂、仪器与实验方法

1.1 试剂与仪器

金银花（干燥），购自上海蔡同德大药房；717型阴离子交换树脂﹑AB-8型大孔吸附树脂及聚酰胺树脂，购自上海华震科技有限公司；芦丁和绿原酸标准品均购自中国药品生物制品鉴定所。

紫外分光光度计（Evolution 220型），美国 Thermo Fisher Scientific公司；pH计（PE20/EL20）及分析天平（ME104E/02），德国 Mettler Toledo公司；超纯水仪（Arium 611DI），德国 Sartorius公司。

1.2 连续色谱分离装置结构示意图

本装置的构建基于金银花水提液中主要的成分为绿原酸﹑黄酮类的特点，采用三根树脂柱进行分级分离：第一根树脂柱装填凝胶型的717型树脂，用于吸附绿原酸；第二根树脂柱装填AB-8型树脂，吸附分离黄酮类化合物；由于MAR对于非黄酮类化合物[10]也有吸附能力，故本装置中第三树脂柱装填聚酰胺树脂（PA），对第二树脂柱的洗脱液进一步分级，实现黄酮的纯化。装置结构如图1所示。

图1 连续色谱分级系统的构建示意图Fig.1 The schematic diagram of the device products

1.3 绿原酸及黄酮的含量测定

1.3.1 总黄酮的含量测定

配制绿原酸标准溶液0.005 mg/mL﹑0.008 mg/mL﹑0.011 mg/mL﹑0.014 mg/mL﹑0.017 mg/mL各一份（溶剂：30%的乙醇-水溶液）。在326 nm波长下测定绿原酸标准品吸光度标准曲线。按相同方法测定待测样品吸光度，并根据线性回归方程得到待测样品中绿原酸含量。

1.3.2 总黄酮的含量测定

配制绿黄酮标准溶液0.004 mg/mL﹑0.008 mg/mL﹑0.012 mg/mL﹑0.016 mg/mL﹑0.020 mg/mL各一份（溶剂：乙醇）。按文献方法[5]处理各标准样品后测定吸光度，绘制线标准曲线如图2所示并得到线性回归方程，按相同方法测定待测样品吸光度，并根据线性回归方程得到待测样品中黄酮含量。

图2 绿原酸（a）及黄酮（b）的吸光度标准曲线（回归方程：ya=0.04107x-0.00253，R2=0.9992；yb=0.0171x-0.0128，R2=0.9996）Figure 2 Standard curve of (a) chlorogenic acid and (b) total flavonoids ( Regression equation : ya=0.04107x-0.00253, R2=0.9992; yb=0.0171x-0.0128, R2=0.9996)

2 结果与讨论

2.1 上样pH对吸附的影响

如图3所示，当上样液的pH值为8时，717型树脂的对绿原酸的吸附量较大。绿原酸是一种有机弱酸，酸性条件下会抑制其电离，使其更多得呈游离态，不利于离子交换的进行，而碱性条件会促使其电离，更利于离子交换过程的进行。但绿原酸在强碱性条件下不稳定，结构易变。因此，717型树脂柱的上样液pH调节至8为宜。

对于AB-8型树脂，当上样液的pH值为4时，其对总黄酮的吸附量较大。MAR在吸附过程中，目标组分需要以分子状态才易于被树脂吸附，故为尽可能提高吸附效果则必须使目标组分在溶液中保持分子状态。酸性化合物在酸性介质中会被抑制其电离作用而保持分子状态，便于被充分吸附。而金银花总黄酮本身具有酚羟基结构，呈弱酸性，当溶液pH值为4时，酚羟基的离子化趋势被抑制而让总黄酮呈游离态，更容易被大孔吸附树脂吸附；而随着pH值的增加，总黄酮离子化的趋势增强，增大了吸附难度。因此，在AB-8树脂柱上样液

的pH条件至4为宜。

图3 上样液pH值与717型树脂（a）和AB-8型树脂（b）吸附量的关系Fig.3 The relationship between the pH value of sample solution and the adsorption capacity of 717 resin (a) and AB-8 resin (b)

2.2 上样体积的影响

2.2.1 717型树脂对绿原酸的吸附容量测试

如图4（a）所示，流分11 中绿原酸含量为0.57 g/L，大于原始上样液中绿原酸含量4.32 g/L的10%，为穿透点，故717型树脂的最佳上样体积为10 BV，即每毫升717型树脂的最适宜上样量为10 mL生药浓度为0.2 g/mL的上样液。

2.2.2 AB-8型树脂对黄酮的吸附容量测试

如图4（b）所示，流分18中总黄酮的含量为0.88 g/L，大于原始上样液中总黄酮含量5.06 g/L的10%，为穿透点，故AB-8型树脂的最适宜上样体积为17 BV，即每毫升AB-8树脂的最适宜上样量为17 mL生药浓度为0.2 g/mL的上样液。

图4 (a) 717型树脂对绿原酸的吸附穿透曲线；(b) AB-8型树脂对总黄酮的吸附穿透曲线

Fig.4 (a) The leaked adsorption curve of the chlorogenic acid on 717 anion exchange resin; (b) The leaked adsorption curve of the total flavonoids on AB-8 resin

2.3 洗脱剂的影响

离子交换树脂在洗脱过程中为了更利于目标物被洗脱，需要使目标物能够在洗脱过程中趋向于游离态。因此在绿原酸的洗脱过程中，采用酸性的乙醇溶液来作为洗脱剂。

乙醇含量对绿原酸的洗脱的影响如表1所示。由表1知，随着乙醇含量的增大，绿原酸的洗脱量随之增加，说明绿原酸的洗脱率在逐渐的增加，洗脱效果越好；但当乙醇的含量达到90%时，绿原酸的洗脱率反而降低，因此最适宜的乙醇含量为乙醇含量为70%的乙醇溶液。

洗脱液pH值对绿原酸的洗脱的影响如表1所示。由表1知，当洗脱液的pH为3时，洗脱液中的绿原酸的洗脱量最大，这是由于绿原酸是一种多羟基的酚酸，在酸性的条件下便于绿原酸趋向于游离态，从而容易被洗脱下来，故随着酸性的增强，对绿原酸的洗脱效果也越好。但是过强的酸性会使得绿原酸发生内酯化反应，从而降低洗脱液中绿原酸的含量，故选择绿原酸的最佳洗脱pH为3。

结合洗脱剂的pH与乙醇含量对绿原酸洗脱效果的影响，确定最适宜的洗脱剂为pH为3的乙醇含量为70%的乙醇水溶液。

表1 乙醇含量与pH对绿原酸洗脱的影响Table1 Effect of different alcohol content and pH on the elution amount of chlorogenic acid

乙醇含量对总黄酮的洗脱的影响如图5所示，结果表明，乙醇体积分数越高，对于总黄酮的洗脱效果越好。但由表1可知，体积分数为70%的乙醇溶液洗脱得到的总黄酮的量与体积分数为90%的乙醇溶液洗脱得到的总黄酮的量差别不大，考虑到实际生产过程中作为溶剂，乙醇的溶剂的成本高于水的成分，因此确定AB-8树脂吸附总黄酮后最适宜的洗脱剂为乙醇体积分数为70%的乙醇溶液。

2.4 洗脱流速与体积的影响

洗脱流速与体积对绿原酸洗脱的影响如表2所示。表2表明，当洗脱液洗脱体积相同时进行洗脱，洗脱率随着流速的降低而升高高，但当流速降低到一定程度时，由于流速的过慢会使洗脱时间增加而相应延长生产周期。故综合考虑，717型树脂的洗脱流速选择2 BV/h为宜。当洗脱液体积达到2 BV时，绿原酸的洗脱率达到74.6%（共吸附得到绿原酸量为200 mg），在此之后基本无绿原酸洗脱出来，综合考虑，717型树脂的洗脱体积为2 BV。

洗脱流速对总黄酮的洗脱的影响如表3所示。表3表明用相同体积的洗脱液洗脱AB-8树脂上吸附的总黄酮，流速越慢，洗脱液与树脂接触越充分，洗脱效果越好，但流速过慢不利于实际生产，因此对宜采用2 BV/h的洗脱流速。当洗脱液体积达到3 BV时，总黄酮的洗脱率达到85.5%（吸附得到的总黄酮量为416 mg），在此之后基本无总黄酮洗脱出来，综合考虑，AB-型树脂的洗脱也体积为3 BV。

表2 洗脱流速与体积对绿原酸洗脱的影响Table2 Effect of different alcohol flow speed and eluent volume on the elution amount of chlorogenic acid

表3 洗脱流速与体积对总黄酮洗脱的影响Table3 Effect of different alcohol flow speed and eluent volume on the elution amount of total flavonoids

2.5 装置的分级方法验证性实验

收集柱1洗脱液和柱3洗脱液，测得柱1洗脱液中含有绿原酸149.1 mg，柱3洗脱液中含有总黄酮163.2 mg。按上述最佳条件重复操作，收集柱2洗脱液，测得洗脱液中含有的总黄酮量为216.4 mg。再将柱1洗脱液﹑柱2洗脱液和柱3洗脱液烘干得到干膏并称重，得到柱1洗脱液﹑柱2洗脱液柱3洗脱液干膏重分别为236.5 mg﹑360.7 mg﹑180.6 mg。柱1洗脱后绿原酸的得率与纯度分别为69.0%（水提液上样体积50 mL﹑绿原酸含量4.32 g/L）与63.0%；柱2洗脱后总黄酮的得率和纯度分别为85.5%（水提液上样体积50 mL﹑总黄酮含量 5.06 g/L）与60.0%，经柱3处理洗脱后总黄酮的得率与纯度变为64.5%与90.3%，说明PA有效将总黄酮与其他杂质分离开，纯度明显提高。

各取5 mL 717型树脂和AB-8型树脂装柱并串联，按最终确定的分级方法上样﹑洗脱，测定，平行5次，测得绿原酸和总黄酮含量的RSD分别为2.9%和3.1%。取12 mL PA，将AB-8树脂洗脱液按最终的分级方法上样，洗脱，测定，平行5次，测得总黄酮的含量的RSD为2.1%。该结果说明本装置分离方法的重复性较好。

同一根树脂重复使用4次，每一次使用完毕后717型树脂酸洗后水洗至中性，AB-8树脂和PA每一次使用完毕后先用乙醇洗再水洗至无醇味。测定每次洗脱液中绿原酸和总黄酮的含量，结果RSD值分别为4.9%﹑4.2%和5.1%。说明树脂重复使用4次，仍能达到要求，故将树脂的使用周期定为4次，4次后需要按照树脂活化方法重新再生树脂方能投入使用。

3 总结

本文采用连续色谱分级分离装置，对金银花水提液中总黄酮和绿原酸实现连续分级分离。通过对装置中不同树脂对于目标组分的吸附洗脱实验，获得装置的各项优化参数，并确定最适宜的分级条件：以2 BV/h的流速上样流经717型树脂和AB-8型树脂，上样液为生药浓度0.2 g/ mL金银花水提液（初始上样pH为8，过717型树脂后调节pH至4），上样体积为10BV，并以2 BV/h的流速用3 BV的70%乙醇溶液（pH为3）﹑2 BV 70%乙醇溶液分别洗脱717型树脂和AB-8树脂；将AB-8树脂洗脱液稀释6.5倍，用5 BV./ h流速过PA柱全部上样，再以3 BV/ h的流速将3 BV的70%乙醇溶液洗脱PA，将总黄酮和其他杂质的分离，得到纯化后的总黄酮纯度为90.3%。该装置实现了金银花水提液中绿原酸﹑总黄酮连续分级，且处理金银花水提液总黄酮和绿原酸分离过程中同步实现了总黄酮的进一步纯化，节约了后期精制的成本。

[1] 刘军海, 裘爱泳, 任惠兰.绿原酸提取与纯化分离方法研究进展[J].粮食与油脂, 2007, (7): 42-45.

[2] 尹青.聚苯乙烯基阴离子交换纤维吸附分离绿原酸的研究[D].天津工业大学, 2008.

[3] 张宏梅, 崔佰吉, 李景华.大孔吸附树脂分离纯化返魂草有效成分的工艺研究[J].中国药房, 2015, 26(31): 4402-4405.

[4] 龚志华, 任国谱, 舒青孝, 等.大孔吸附树脂分离纯化金银花绿原酸研究[J].分析测试学报, 2011, 30(1): 85-90.

[5] 于启平, 王菁.金银花中提取分离总黄酮的工艺研究[J].中国医药指南, 2012, 10(32): 87-88.

[6] 吴绍康, 沈先荣, 梅威威, 等.大孔吸附树脂分离纯化枇杷花总黄酮工艺研究[J].中华中医药学刊, 2014(9): 2185-2188.

[7] 司建志, 王硕, 周小雷, 等.聚酰胺纯化八角残渣黄酮的工艺研究[J].食品工业科技, 2015, 36(8): 245-249.

[8] 方小燕.聚酰胺树脂在分离纯化黄酮中的应用研究[J].海峡药学, 2013, 25(5): 41-42.

[9] 金慧鸣, 郭红英, 谭兴和, 等.大孔吸附树脂-聚酰胺联用纯化茅岩莓总黄酮工艺优化[J].食品科学, 2016, 37(12) : 13-18.[10] 刘霞, 岐琳, 李延, 等.大孔吸附树脂纯化鹿药总皂苷和总黄酮的研究[J].西北药学杂志, 2012, 27(6): 516-519.

Application of Continuous Grading System for Active Natural Products from Honeysuckle

Zheng Nairen, Shen Jie2, Chu Zhan Ying2, Zhang Weibing2, Deng Yulin1*
(1.Beijing Institute of Technology, Beijing, 100081; 2.East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

The natural product continuous grading chromatographic device was applied to the continuous fractionation of chlorogenic acid and total flavonoids in the aqueous extract of honeysuckle.The effects of the concentration of the sample, the pH of the sample solution and the eluent, the loading and the elution flow rate, loading volume, the ethanol content in the elution, the elution rate and the amount of the eluent on the grading efficiency were studied to obtain chlorogenic acid and total flavonoids in the extract of honeysuckle by the 717 type anion exchange resin, AB-8 macroporous adsorption resin and polyamide columns.The total flavonoids were further separated by polyamide column.The final yields of chlorogenic acid and total flavonoids were 71% and 64% with purities of 63.0% and 90.3%, respectively.

continuous grading device; honeysuckle; active natural product

TS244 [Document Code] A

10.11967/ 2017150211

TS244

A DOI：10.11967/ 2017150211

国家重大科学仪器设备开发专项课题（2012YQ04014005）

郑乃仁，男，北京理工大学博士研究生，生物化工专业

邓玉林，男，北京理工大学教授，研究方向：帕金森病的分子生物学病因﹑蛋白质组学﹑植物药物活性成分分离制备与新药研发﹑航天生物与医学工程，Email：deng@bit.edu.cn.