雌二醇对EOMA细胞增殖、ERα、ERβ及VEGF表达的影响*

宋晓峰，王 宁，李亚莎，金先庆，王 佚，李晓庆，周德凯

(重庆医科大学附属儿童医院胃肠外科及新生儿外科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

雌二醇对EOMA细胞增殖、ERα、ERβ及VEGF表达的影响*

宋晓峰，王 宁，李亚莎，金先庆，王 佚，李晓庆，周德凯△

(重庆医科大学附属儿童医院胃肠外科及新生儿外科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

目的 探讨17β-雌二醇(E2)对鼠源性血管瘤血管内皮细胞(EOMA细胞)生长，雌激素α、β受体亚型(ERα、β)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 用1、10、100 nmol/L 浓度的E2分别作用于EOMA细胞，同时设对照组(不加E2)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同时间点其对EOMA细胞生长的影响；Western blot检测EOMA细胞的ERα、β表达强度；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF的分泌水平。结果 1 nmol/L E2组在36 h时高于对照组(P<0．05)；10 nmol/L E2组、100 nmol/L E2组各个时间点OD值均明显高于对照组(P<0．05)，36 h时OD值最高(P<0．01)。E2作用下10 nmol/L E2组ERα和ERβ水平及100.0 nmol/L E2组ERα水平较对照组均明显增高(P<0．05)。24、48 h时，各浓度E2组与对照组的VEGF水平比较均差异有统计学意义(P<0．05)，48 h时100 nmol/L E2组和10 nmol/L E2组VEGF水平均高于1 nmol/L E2组(P<0．05)。结论 E2可促进EOMA细胞增殖，可能主要通过ERα、VEGF表达水平上调来实现。

雌二醇；雌激素受体α；雌激素受体β；内皮，血管；血管瘤；鼠源性血管内皮瘤内皮细胞；血管内皮生长因子

血管瘤是婴幼儿最常见的肿瘤，发病率高达3%～8%。部分血管瘤可出现严重的并发症，造成患儿机体功能障碍，严重毁损容貌，甚至危及生命。而血管瘤的发病原因、影响其生长的因素目前仍不清楚。有研究发现血管瘤的发生及生长与雌激素密切相关[1-3]。雌激素通过雌激素受体(ER)发挥生理效应，ER有α和β两种亚型，二者在雌激素作用下如何发挥效应有待进一步研究。本实验拟通过观察17β-雌二醇(E2)对血管瘤血管内皮细胞的增殖、血管内皮生长因子(VEGF)及ERα、ERβ表达的影响，探讨雌激素影响血管瘤发生及增殖调控的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 鼠源性血管内皮瘤内皮细胞(EOMA细胞)购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)；DMEM/F-12细胞培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Invitrogen公司；兔抗小鼠ERα抗体、兔抗小鼠ERβ抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；羊抗人肌动蛋白(actin)抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体及兔抗羊IgG抗体购自北京中杉生物技术公司；E2购自美国Sigma公司；VEGF抗体包被板购自北京四正柏生物科技有限公司；凯基全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

表1 各组不同时间点OD值比较

a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与同组36 h比较；c：P<0.05，与1 nmol/L E2组比较。

1.2 方法

1.2.1 血管瘤血管内皮细胞培养和传代 EOMA细胞接种在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12高糖培养基中，置于5%CO237 ℃，饱和湿度的培养箱中培养；常规传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测E2对EOMA细胞增殖的影响 EOMA细胞以1×105/mL的浓度接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h在细胞单层铺满孔底后加入不同浓度的E2，使其培养液中终浓度分别为1、10、100 nmol/L(分别为1、10、100 nmol/L E2组)，每个浓度设6个复孔，同时设正常对照组(不加E2)和空白对照组(与实验平行不加细胞，其他条件相同的对照孔，比色时以空白孔调零)。培养12、24、36 h后分别于每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，继续培养4 h后，终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上选择490 nm波长，测定细胞各孔光密度值(OD值)。实验重复3次，取其平均值分析。

1.2.3 Western blot检测ERα、ERβ蛋白在EOMA细胞中的表达水平 EOMA细胞接种于培养瓶中，在细胞接近铺满瓶底后加入不同浓度的E2，使其培养液中终浓度分别为1、10、100 nmol/L(分别为1、10、100 nmol/L E2组)，每个浓度设5个培养瓶，同时设对照组(加入等体积溶剂)。培养24 h后收集EOMA细胞，凯基全蛋白提取试剂盒按步骤提取全蛋白。蛋白样品按4∶1比例加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液中，沸水浴加热后电泳。电泳完毕后，将目的蛋白位置的浓缩胶切下，置入电转缓冲液中；SDS-PAGE 凝胶在电转缓冲液中浸泡后，将滤纸、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和SDS-PAGE 凝胶安装好并置入电转槽中，100 v恒压转膜90 min；电转完毕，取下PVDF膜置入TBS-T中漂洗，根据Marker剪出所需的蛋白的PVDF膜；将PVDF膜置于封闭液中，常温下轻微摇动1 h；TBS-T洗PVDF膜；分别加入稀释一抗，置入4 ℃冰箱孵育过夜(稀释比例：兔抗小鼠ERα抗体为1∶200，兔抗小鼠ERβ抗体为1∶200，羊抗人β-actin为1∶3 000)；TBS-T洗PVDF膜；分别加入1∶5 000稀释二抗孵育1 h；TBS-T洗PVDF膜；电化学发光(ECL)试剂盒进行化学发光，成像并存储数据；Quantity-One软件获得同次电泳所得的目的蛋白和β-actin条带灰度值数据，以各组的目的蛋白/β-actin的灰度比值作为相对表达水平。

1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF的分泌水平 EOMA细胞以1×105/mL的浓度接种于24孔板，每孔0.5 mL，培养24 h在细胞单层铺满孔底后加入不同浓度的E2，使其培养液中终浓度分别为1、10、100 nmol/L(分别为1、10、100 nmol/L E2组)，每个浓度设5个复孔，同时设溶剂对照组(不加E2，加入等体积溶剂)。培养24、48 h后分别收集培养上清液。ELISA法检测不同培养条件下细胞上清液中VEGF的分泌水平。在450 nm下测OD值，VEGF浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出各组的VEGF浓度。

2 结 果

2.1 MTT法检测E2对EOMA细胞增殖活性的影响 1 nmol/L E2组在12、24 h和正常对照组差异无统计学意义(P=0.086、0.154)，在36 h时高于正常对照组(P<0．05)；10、100 nmol/L E2组各个时间点OD值均明显高于正常对照组(P<0．05)，36 h时OD值最高(P<0．01)。36 h时，1 nmol/L E2组与10 nmol/L E2组、100 nmol/L E2组OD值比较差异有统计学意义(P<0.05)，10 nmol/L E2组与100 nmol/L E2组比较差异无统计学意义(P=0.275)，见表1。

2.2 Western blot检测E2对EOMA细胞ERα、ERβ蛋白表达水平的影响 E2作用下对照组中ERα蛋白表达强度大于ERβ(P=0.047)。E2作用下ERα 10 nmol/L E2组及100 nmol/L E2组较对照组均明显增高(P<0．05)，但不同剂量组间比较差异无统计学意义(P>0．05)。E2作用下ERβ表达数值较对照组有上升趋势，但仅100 nmol/L E2组较对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)，不同剂量组比较差异无统计学意义(P>0．05)，见图1、表2。

A：β-Actin；B：ERα；C：ERβ。

图1 Western blot检测ERα、ERβ蛋白表达

2.3 ELISA 法检测细胞培养上清液中VEGF的分泌水平 与溶剂对照组比较，不同浓度E2均增加EOMA细胞VEGF的分泌水平。24、48 h时，各浓度E2组与溶剂对照组的VEGF水平比较均差异有统计学意义(P<0．05)。24 h时各浓度E2组间比较差异无统计学意义(P>0．05)；48 h时100 nmol/L E2组和10 nmol/L E2组均高于1 nmol/L E2组(P<0．05)。同组在各个时间点间比差异无统计学意义(P>0．05)，见表3。

表2 Western blot检测EOMA细胞ERα、ERβ蛋白表达水平

a：P<0.05，与对照组比较。

组别24h48h溶剂对照组129.74±8.28167.00±11.051nmol/LE2组226.12±50.42a233.64±28.75a10nmol/LE2组242.92±40.21a293.60±19.87ab100nmol/LE2组279.26±34.98a313.78±42.92ab

a：P<0.05，与溶剂对照组比较；b：P<0.05，与1 nmol/L E2组比较。

3 讨 论

临床观察发现血管瘤瘤体增生与高水平雌激素有着密切联系：血管瘤患儿女性明显多于男性；肝硬化患儿由于肝功能减退，灭活雌激素的能力降低而出现肝掌、蜘蛛痣；裸鼠血管瘤移植模型在适当的外来雌激素的干预下，移植肿瘤增殖稳定；课题组前期研究也发现血管瘤患儿血清E2水平明显高于对照组。

雌激素是一种重要的脂溶性类固醇激素，主要由卵巢、睾丸及肾上腺皮质分泌产生，主要包括E2、雌酮(estrone，E1)和雌三醇(estriol，E3),其中浓度最高且生理活性最强的是E2[4]。

经典理论认为雌激素通过与其受体结合而发挥生理作用，其生理作用主要由ERα、β两种亚型介导，ERα和ERβ由不同的基因编码，具有不同的cDNA和蛋白质分子结构，在不同组织器官中分布不同及相应mRNA表达差异是对雌激素靶器官和组织的生理、病理产生不同影响的雌激素作用的组织特异性的物质基础[5]。基因表达图谱显示ERα能够上调与细胞生长相关基因的表达，而ERβ能调节与信号转导、细胞周期进展及细胞凋亡相关基因的表达[6]。学者研究发现E2干预下可影响胃癌细胞株的增殖活力和ERα蛋白质表达水平[7]。E2刺激膜相关的结合位点ER并诱导快速的细胞内信号转导和组织反应，其中ERα转染的乳腺癌细胞与ERα阴性对照细胞相比细胞增殖增加[8]。研究发现大鼠子宫同时有ERα、ERβ两种受体亚型的表达，但ERα mRNA表达水平明显强于ERβ，E2可明显上调去势大鼠子宫ERα的mRNA表达，但对ERβ无明显作用，推测E2可通过ERα/ERβ比率升高，改变二聚体构成，促进子宫内膜的增殖[9]。

ERα、ERβ在血管瘤上皮细胞增殖中的作用机制尚不明确，二者是共同介导了雌激素对血管瘤上皮细胞的增殖作用，还是相互拮抗发挥生物学效应，需要实验进一步研究。课题组在前期研究基础上发现ERα、ERβ在EOMA细胞胞质均有表达，ERα的表达水平显著高于ERβ，推测ERα为雌激素作用的经典靶组织。本次实验通过MTT、Western blot、ELISA法检测E2对EOMA细胞增殖、对ERα、ERβ表达强度及对VEGF的分泌水平的影响。

在MTT法检测E2对EOMA细胞增殖的影响实验中观察到：不同剂量组在各个时间点表现出效应-时间相关性，推测雌激素的促进增殖效应可能与E2作用时间有关。100 nmol/L E2组与10 nmol/L E2组OD值比较差异无统计学意义，推测可能与E2作用下ER饱和有关。1 nmol/L E2组在36 h时与100 nmol/L E2组、10 nmol/L E2组OD值比较差异有统计学意义，表现出在一定浓度范围内的剂量-效应相关性。通过MTT实验可以看出E2有明显的促进EOMA细胞增殖的作用，同时表现出时间、剂量-效应相关性。

通过Western blot检测ERα、ERβ 蛋白在EOMA细胞中的表达水平，实验结果显示：E2作用下对照组中ERα蛋白表达强度高于ERβ，和课题组前期通过其他检查方式得出的结论一致，即ERα的表达显著高于ERβ。在10、100 nmol/L的E2作用下可上调ERα蛋白的表达水平。仅100 nmol/L剂量的E2可上调ERβ蛋白的表达水平。推测E2主要通过上调ERα的表达发挥生理效应，这和其他学者的发现一致。

VEGF是一个高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，对血管内皮细胞有强烈的促分裂和趋化作用，能特异性地刺激内皮细胞增殖，还具有促血管通透性作用。学者研究发现血管瘤细胞中ER的阳性表达与VEGF阳性表达呈正相关，雌激素和VEGF同时存在时，对血管瘤血管内皮细胞的促增殖作用更加显著，二者存在协同作用[10-12]。Hyder等[13]进一步研究发现：VEGF基因上有2个核苷酸序列与ER基因中的雌激素反应元件高度同源，分别位于VEGF基因的5和3非翻译区，这2个序列可与ER特异性地结合，雌激素与ER结合可影响VEGF的表达。

课题组通过ELISA 法检测细胞培养上清液中VEGF的分泌水平，实验结果显示：3个浓度的E2均增加EOMA细胞VEGF的分泌水平，与对照组比较均有显著差别，24 h时不同剂量组间比较差异无统计学意义，48 h时1 nmol/L E2组分别与10 nmol/L E2组、100 nmol/L E2组比较差异有统计学意义，提示存在剂量-时间-效应相关性。但同一剂量组在两个时间点间比较没有显著差异。

本次研究结果显示E2能增加EOMA细胞VEGF的分泌，并协同VEGF促进EOMA细胞的增殖水平；E2上调ERα、ERβ的表达，其效应以上调ERα更为显著，推测E2主要通过ERα信号通路调节血管瘤内皮细胞的增殖。本次研究进一步证实了血管瘤生长的雌激素依赖性，为血管瘤发生及增殖机制的研究提供新的实验依据。同时由于当前临床对于血管瘤的治疗往往是经验性的，缺乏充分的理论基础及实验依据，而深入的对雌激素及其受体的研究有助于为血管瘤的基因或内分泌治疗提供新的靶点，为诊断及指导治疗提供新的思路。

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Effect of E2on the expression of estrogen receptor α，β and VEGF and the proliferation of EOMA cells*

SongXiaofeng,WangNing,LiYasha,JinXianqing,WangYi,LiXiaoqing,ZhouDekai△

(DepartmentofGastrointestinalandNeonatalSurgery,theChildren′sHospital,ChongqingMedicalUniversity/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders/ChongqingInternationalScienceandTechnologyCooperationCenterforChildDevelopmentandDisorders/KeyLaboratoryofPediatricsinChongqing，Chongqing400014,China)

Objective To explore the effect of 17β-estradiol (E2) on proliferation of murine endothelial (EOMA) cells and the expression of estrogen receptor(ERα and ERβ) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Methods Different concentrations of E2(1,10,100 nmol/L) were used in EOMA cells.At the same time,We set the control group (without E2).MTT assay was used to detect the effect of EOMA on the growth of EOMA cells at different time points.Western blot was used to detect the expression of ERα and β in EOMA cells;and the secretion level of VEGF in supernatant was detected by ELISA．Results TheODvalue of E2group(10 nmol/L) was significantly higher than that of control group at 36 h(P<0.05).TheODvalues of E2group(10 nmol/L and 100 nmol/L)were significantly higher than that of control group(P<0.05) at each time,and theODvalue was the highest at 36 h(P<0.01).The expression of ERα and ERP in EOMA cells cultured with E2(10 nmol/L) and the expression of ERα in EOMA cells cultured with(100 nmol/L) were significantly higher than those in the control group(P<0.05).At 24,48 h,the expression of VEGF of each E2group was higher than that of the control group;and at 48 h,the VEGF levels in the E2group(10 nmol/L and 100 nmol/L)were significantly higher than E2group(1 nmol/L)(P<0.05)．Conclusion E2could promote the proliferation of EOMA cells,mainly through the expression of ERα,VEGF to achieve.

estradiol;estrogen receptor alpha;estrogen receptor beta；endothelium,vascular；hemangioma；murine endothelial cells；vascular endothelial growth factor

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.003

国家临床重点专科建设项目(国卫办医函[2013]544)；重庆市自然科学基金资助项目(cstc2011jjA10087)；重庆市卫生局基金资助项目(2011-2-252)；重庆市教委科学技术研究资助项目(KJ120308)。 作者简介：宋晓峰(1970-)，副主任医师，博士，主要从事血管瘤发病机制及治疗方面研究。△

，E-mail:732587579@qq.com。

R726.5

A

1671-8348(2017)14-1878-03

2016-11-24

2017-01-12)