肉桂双瓣卷蛾为害对樟树叶片挥发物的影响

邱华龙，赵丹阳，莫 羡，徐金柱，揭育泽，秦长生*

(1. 广东省林业科学研究院，广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州 510520；2. 中山市林业有害生物防治检疫站，广东中山 528400)

肉桂双瓣卷蛾为害对樟树叶片挥发物的影响

邱华龙1，赵丹阳1，莫 羡2，徐金柱1，揭育泽1，秦长生1*

(1. 广东省林业科学研究院，广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州 510520；2. 中山市林业有害生物防治检疫站，广东中山 528400)

采用顶空固相微萃取(SPME)及气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)技术分析肉桂双瓣卷蛾为害前后的樟树叶片挥发物变化。结果表明，健康和虫伤的樟树叶片中均含有26种相同的挥发物成份，但是肉桂双瓣卷蛾为害后挥发物的相对含量发生显著变化。肉桂双瓣卷蛾危害后，叶片中的黄樟素含量显著增高，健康叶片中黄樟素仅占0.6%，而虫伤叶片中为2.7%；但是反-水合倍半香桧烯、顺-橙花叔醇、反-橙花叔醇及α-红没药烯含量均显著降低，健康叶中分别含1.9%、4.5%、11.6%和1.2%，而虫伤叶片中分别占0.6%、2.1%、7.0%和0.7%。挥发物组分含量变化可能在调控害虫取食、天敌对猎物的搜寻等行为过程中发挥作用。本研究为探索植物挥发物对害虫及天敌行为的影响奠定基础，为了解寄主-昆虫-天敌三层营养关系的相互作用、利用天然活性化合物防治害虫提供理论依据。

肉桂双瓣卷蛾；叶片；顶空固相微萃取；气象色谱-质谱；挥发物

肉桂双瓣卷蛾Polylophacassiicola隶属于鳞翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，主要寄主为肉桂Cinnamomumcassia、樟树C.camphora和黄樟C.Porrecium(彭石冰等，1992)。该虫以幼虫钻食寄主植物的嫩梢，造成新梢大量死亡，主梢不断枯死，侧梢丛生(图1)。肉桂双瓣卷蛾在我国1年发生6-7代，第1代幼虫于5月下旬开始出现，第2-4代世代重叠明显，每个世代约30 d(赵丹阳等，2016)。该虫具趋嫩产卵习性，只选择在新抽嫩梢上产卵，嫩梢长达2 cm以上时是其大量产卵危害期。成虫产卵于樟树叶背面，5-8 d后卵孵化为幼虫，初孵幼虫沿叶柄爬至嫩梢、嫩叶，从嫩叶主脉或芽顶直接钻蛀入髓心为害(图1a)，4-5 d后叶芽出现枯萎状(图1b)，此时为1龄幼虫；2龄幼虫蛀入嫩梢为害，当蛀道达2 cm左右时嫩梢有萎蔫状变化；3龄幼虫大量取食，蛀道约4-7 cm，梢部完全枯萎(图1c)；老熟幼虫掉头回到嫩梢上方咬1小孔吐丝下垂落地，寻找合适的地方化蛹(郑宝荣，2007)。

目前在农林生产上主要是利用化学药剂防治肉桂双瓣卷蛾，而尚未有利用寄主植物释放的化学信息素监测和防治肉桂双瓣卷蛾的相关报道。植物产生并释放的挥发性物质是形成植物气味特征的主体，其组成成分与比例构成了该种植物的化学指纹图(Dicke, 2016)。这些气味物质调控着昆虫的多种行为，诸如寄主定向、产卵、逃避、取食、聚集和传粉等(刘芳等，2003；郭祥令等，2011)。因此，研究这些物质，对于研究植物挥发物对昆虫行为的影响有着非常重要的意义，可以探索昆虫各种行为的内在机理，更好地了解寄主-昆虫-天敌三层营养关系的相互作用，为利用天然活性化合物防治害虫及生物防治提供理论依据。目前植物挥发物提取的方法主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、抽气吸附法、动态顶空采集法和固相微萃取法(SPME)。其中SPME具有无需有机溶剂、灵敏度高、操作简单、重现性好、防止二次污染等优点，集采样、萃取、浓缩、进样、分析于一体，可以直接与气相色谱或液相色谱相联(孙凡等，2008)。文中采用SPME技术对健康及肉桂双瓣卷蛾为害的刚抽出的樟树嫩叶的挥发物进行了采集和分析，然后采用气谱质谱联用技术对其挥发物进行分离与鉴定，以期为肉桂双瓣卷蛾的监测和防治提供理论依据。

图1 肉桂双瓣卷蛾为害樟树状Fig.1 Cinnamum camphora was damaged by larvae of Polylopha cassiicola注：a，肉桂双瓣卷蛾幼虫；b，肉桂双瓣卷蛾危害后初期症状；c，肉桂双瓣卷蛾危害后后期症状。Note: a, Larva of Polylopha cassiicola; (b), Damage symptom of P. cassiicola at early satge;c, Damage symptom of P. cassiicola at late satge.

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试植物为樟树新抽嫩梢上的嫩叶，实验样品采自广州市天河区广东林科院苗圃内。采集刚受肉桂双瓣卷蛾为害的嫩梢上的新鲜叶片，设为虫伤组；采集健康无损的嫩梢叶作为健康对照组，每组各重复4次。

1.2 试验方法

实验仪器为顶空固相微萃取装置收集挥发物，固相微萃取采用PDMS(100 μm)涂层的萃取头(Supelco公司，美国)。将刚采集的健康和虫伤的2-3个嫩梢(每个嫩梢含3-6片嫩叶，每片嫩叶长约1-2 cm)放入15 mL样品瓶中，瓶盖上还有硅胶隔垫，将萃取头从隔垫插入瓶中，伸出萃取头，使萃取头在叶片的正上方，然后置于恒温培养箱中，35℃条件下萃取40 min，将收集的挥发物用于后续分析。

利用岛津气象色谱-质谱联用仪(GC-MS，岛津QP2010 Ultra)对收集到的挥发物进行分析。色谱柱为岛津SH-RXI-5SIL MS毛细管柱(30 m × 0.25 μm × 0.25 mm)，载气为99. 99%高纯氦气，流速1.2 mL/min。进样口温度250℃，质谱采用EI电离方式，离子源温度250℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃。柱升温程序为初始温度40℃保留3 min，以5℃/min升至200℃，再以30℃/min升至250℃，保留4 min。采用不分流进样，溶剂延迟3 min。

1.3 数据分析

利用岛津GC-MS工作站(GC-MS solution 2.7)对挥发物的离子谱图的峰进行定性和相对定量分析。采用SIMCA-P Version 15软件包(Umetrics Umea, Sweden)对数据进行分析。将每个挥发性化合物峰的相对百分含量进行反正弦转换，用于主成分PCA建模分析。利用SPSS(V22, IBM)软件一般线性模型(General linear model: GLM)中的多元方差分析(SPSS-MANOVA)检验虫伤和健康叶片挥发性化合物的物质及含量差异。利用R(Version 3.3.1)软件中的vegan软件包进行聚类和变量之间的相关性分析。

2 结果与分析

健康叶片和虫伤叶片的挥发性物质的GC-MS总离子流图如图2所示。通过NIST谱库检索，从健康叶片和虫伤叶片的离子色谱图中均鉴定出26种挥发性物质(表1)。健康叶片中，含量最高的前5种挥发物为异丁香烯、反-橙花叔醇、β-芹子烯、(反)3,7-二甲基-3,6-辛二烯醛和芳樟醇。

图2 健康叶片和虫伤叶片挥发物的GC-MS总离子流图Fig.2 Gas-chromatogram of volatiles of normal and insect damaged leaves

编号Number出峰时间Retentiontime化合物名称CompoundnameCAS号CASNumber相对百分含量(%)Relativecontent健康叶Healthy虫伤叶InsectdamagedP值Pvalue11267反⁃β⁃罗勒烯Beta⁃trans⁃Ocimene3779⁃61⁃119±0716±09053621301顺⁃β⁃罗勒烯Bbeta⁃cis⁃Ocimene3338⁃55⁃442±1236±19049131475芳樟醇Linalool78⁃70⁃659±1579±24028141659(顺)3，7⁃二甲基⁃3，6⁃辛二烯醛Isoneral106⁃26⁃321±0219±0404751722(反)3，7⁃二甲基⁃3，6⁃辛二烯醛Isogeranial1754⁃00⁃374±1179±41081261783异环柠檬醛 2，4，6⁃Trimethyl⁃4⁃cyclohexene⁃1⁃carboxaldehyde1335⁃66⁃626±1116±06008771840顺马鞭草烯醇Cis⁃Verbenol1845⁃30⁃316±0409±05009681884顺式柠檬醛Neral5392⁃40⁃514±0308±04015592026黄樟素Safrole94⁃59⁃706±0327±220042∗102268蒎烯Copaene3856⁃25⁃516±0119±160954112353异丁香烯Isocaryophyllene118⁃65⁃013±2816±230117122383石竹烯Caryophyllene87⁃44⁃510±0515±090526132437双环吉马烯Beta⁃Cyclogermacrane37839⁃63⁃723±1013±0500951424674⁃(1，5⁃二甲基⁃1，4⁃己二烯基)⁃1⁃甲基环己烯4⁃[(1E)⁃1，5⁃Dimethyl⁃1，4⁃hexadienyl]⁃1⁃methyl⁃1⁃cyclohexene29837⁃07⁃813±0708±0304941524831，5，9，9四⁃甲基⁃1，4，7环⁃十一碳三烯1，5，9，9⁃Tetramethyl⁃1，4，7⁃cycloundecatriene不详Unknow83±00478±310583162516gamma⁃姜黄烯Gamma⁃Curcumene451⁃55⁃815±0209±04014172528衣兰烯Ylangene14912⁃44⁃819±0311±090203182571β⁃芹子烯Beta⁃Selinene17066⁃67⁃0103±08105±080692192585α⁃芹子烯Alpha⁃Selinene473⁃13⁃249±0548±010728202626反⁃水合倍半香桧烯Cis⁃Sesquisabinene119238⁃96⁃919±0606±020005∗212660顺⁃橙花叔醇Nerolidol7212⁃44⁃445±1021±060005∗222742反⁃橙花叔醇E⁃Nerolidol40716⁃66⁃3116±2170±24004∗232778α⁃红没药烯Alpha⁃Bisabolene495⁃62⁃512±0407±020039∗242815(E)⁃beta⁃金合欢烯 (E)⁃beta⁃⁃Famesene18794⁃84⁃817±0506±030065253020庚⁃2⁃基酯外型3⁃甲基丁酸⁃1，7，7⁃三甲基二环[221]庚⁃2⁃基酯3⁃Methyl⁃but⁃2⁃enoicacid，1，7，7⁃trimethyl⁃bicyclo[221]hept⁃2⁃ylester不详Unknow12±0408±0603032631133⁃甲基⁃2⁃丁烯酸苯酯3⁃Methyl⁃2⁃butenoicacid，tridec⁃2⁃ynylester不详Unknow34±2228±150639

注：相对百分含量为平均值±标准差；P值是健康和虫伤叶片间的差异显著性，P≤0.05表明差异显著。Note: The relative contents of volatiles were indicated by means ± SD;Pvalues represent the level of difference of each volatile between normal and insect damaged leaves,P≤0.05 means significant difference.

多元方差分析结果表明，虫伤叶片和健康叶片之间的挥发物区别较明显，接近显著性水平(Pillai’s Trace=0.999，F1, 6=187.64，P=0.056)。单变量组间比较结果表明，虫伤叶片和健康叶片之间的黄樟素、反-水合倍半香桧烯、顺-橙花叔醇、反-橙花叔醇和α-红没药烯相对含量具有显著差异(P≤0.05，P值分别为0.042，0.005，0.005，0.04和0.039)(表1)。

通过主成分分析对健康叶片和虫伤叶片的挥发性物质进行二维和三维PCA建模分析，表明虫伤叶片和健康叶片样本可以在得分图中明显区分开来，并且三个主成分对模型的解释率分别为RX[1]=39.8%、RX[2]=22.4%和RX[3]=18.3%，累积的解释率R2Xcum=80.4%(图3a, b)。Cluster聚类分析表明，所有对照样本均聚为一支，虫伤叶片三个样本(T1-T3)聚为一支，而样本4(T4)单独为一分支(图3c)。

图3 主成分和聚类分析比较虫伤和健康叶片的挥发物差异Fig.3 Analysis of volatiles between normal and insect damaged leaves with PCA and cluster methods注：a,二维PCA得分图;b,三维PCA得分图模型，其中黑色代表健康叶片，红色代表虫伤叶片；c,健康(CK-CK4)和虫伤(T1-T4)叶片样本聚类分析图。Note: a, 2-D scores plot;b, 3-D scatter plot of PCA model, in which black and red symbles represent normal and insect damaged leaves, respectively； c, cluster plot of four normal leaves samples(CK1-CK4) and four insect damaged leaves samples (T1-T4).

3 结论与讨论

本研究结果表明，樟树嫩叶受肉桂双瓣卷蛾幼虫为害后，叶片中的挥发物的相对含量发生变化，其中黄樟素的含量显著升高。据研究报道，植物在遭受植食性昆虫或病原菌危害时，挥发物组分的质和量会发生改变，从而影响害虫和媒介昆虫取食、天敌对寄主或猎物的搜寻等行为(Cusumanoetal., 2015；杨玉枝等，2015)。害虫取食寄主植物叶片后，诱导植物释放挥发性化合物驱避其它植食性昆虫。其它昆虫通过感应寄主植物挥发物含量变化而得知植物上已存在竞争者、食物质量降低或植物已启动化学防御等而远离受害植物(Dicke, 2016)。例如，经过斜纹夜蛾Spodopteralittoralis取食诱导的水稻挥发物对褐飞虱具有明显的拒避效果(Xuetal., 2002)；菜粉蝶Pierisrapae更喜欢在健康且未受其它昆虫取食为害的寄主植物上产下后代(严善春等，2007)。此外，研究报道捕食性天敌和寄生性天敌在和害虫的协同进化过程中，可以利用害虫或其寄主植物释放的化学信号物质对猎物进行远距离定位(Steinbergetal., 1993)。比如，小黑瓢虫Delphastuscatalinae对健康、机械损伤、烟粉虱卵危害和烟粉虱若虫危害的花菜植株所产生的挥发性物质选择性实验表明，虫害诱导后，花菜植株的挥发物对小黑瓢虫的引诱效果显著增强(徐桂萍，2011)。因此，推测樟树被肉桂双瓣卷蛾为害后，可能通过释放黄樟素驱避其它害虫继续为害，或者引诱天敌如螟黄赤眼蜂Trichogrammachilonis控制肉桂双瓣卷蛾的种群数量。然而，在植物和昆虫的协同进化中，有些虫害诱导的植物挥发物可以让害虫受益。例如三叶杨叶甲Chrysomelapopuli(Kendrick and Raffa, 2006)和白杨叶甲Chrysomelapopuli(Brillietal., 2009)取食诱导的植物挥发物均对同种昆虫具有较强的引诱作用。因此，受肉桂双瓣卷蛾为害后，黄樟素含量升高，其具体的生态功能还有待于进一步研究。

在本研究中，反-水合倍半香桧烯、顺-橙花叔醇、反-橙花叔醇及α-红没药烯受肉桂双瓣卷蛾为害后相对含量均显著降低，推测可能是嫩叶受虫害后，光合作用及代谢能力减弱，影响物质的合成和释放。研究报道寄主植物受害虫危害后，将更多的能量用于自身的免疫防御从而减少挥发物的合成和释放(Kaloshian and Walling, 2016)。此外，研究报道虫口密度和危害时间等因素会影响寄主植物挥发物的释放，茶丽纹象甲Myllocerinusaurolineatus、假眼小绿叶蝉Empoascavitis、茶尺蠖Ectropisobliquehypulina危害诱导茶树产生的吲哚在达到释放顶峰后，其释放量会随着危害时间的延长而逐步减少(蔡晓明，2009)。由于樟树叶片挥发物的组分种类较多，这些挥发物释放时空动态节律、对肉桂双瓣卷蛾的作用方式及各组分之间的相互协同作用等问题还需要深入研究，才有可能将这些植物挥发物更好地应用于肉桂双瓣卷蛾的生物防治中。

References)

Brilli F, Ciccioli P, Frattoni M,etal. Constitutive and herbivore-induced monoterpenes emitted byPopuluseuroamericanaleaves are key volatiles that orientChrysomelapopulibeetles [J].PlantCell&Environment, 2009, 32 (5): 542-552.

Cai JM. The Emission of Tea Plant Volatiles Induced by Three Herbivore Insect Pests [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009. [蔡晓明. 三种茶树害虫诱导茶树挥发物的释放规律[D]. 中国农业科学院, 2009]

Cusumano A, Weldegergis BT, Colazza S,etal. Attraction of egg-killing parasitoids toward induced plant volatiles in a multi-herbivore context [J].Oecologia, 2015, 179 (1): 163-174.

Dicke M. Induced plant volatiles:Plant body odours structuring ecological networks [J].NewPhytologist, 2016, 210 (1): 10-12.

Guo XL, He YR, Wang DS,etal. Behavioral responses ofTrichogrammatoideabactraeto volatiles of cruciferous vegetables [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2011, 33 (1): 74-80. [郭祥令, 何余容, 王德森,等. 卷蛾分索赤眼蜂对十字花科蔬菜挥发性物质的行为反应[J]. 环境昆虫学报, 2011, 33 (1): 74-80]

Kaloshian I, Walling LL. Plant immunity:Connecting the dots between microbial and hemipteran immune responses [J].ManagementofInsectPeststoAgriculture, 2016: 217-243.

Kendrick AP, Raffa KF. Sources of insect and plant volatiles attractive to cottonwood leaf beetles feeding on hybrid poplar [J].JournalofChemicalEcology, 2006, 32 (12): 2585-94.

Liu F, Lou YG, Cheng JA. Herbivory insect induced plant volatiles:Evolutionary products of plant-herbivore-natural enemy interactions [J].EntomologicalKnowledge, 2003, 40 (6): 481-486. [刘芳, 娄永根, 程家安. 虫害诱导的植物挥发物:植物与植食性昆虫及其天敌相互作用的进化产物[J]. 昆虫知识, 2003, 40 (6): 481-486]

Peng SB, Jiang ZS, Li JQ,etal. Study on the biology and control ofCophoprorasp. inCinnamomumcassia[J].ForestResearch, 1992,1: 82-88. [彭石冰, 江祖森, 李锦权, 等. 肉桂双瓣卷蛾生物学特性及防治研究[J]. 林业科学研究, 1992,1: 82-88]

Steinberg S, Dicke M, Vet LEM. Relative importance of infochemicals from first and second trophic level in long-range host location by the larval parasitoidCotesiaglomerata[J].JournalofChemicalEcology, 1993, 19 (1):47-59.

Sun F, Ru JH, Li R,etal. Analysis of volatile component ofUlmuspumilaby solid phase microextraction coupled with GC-MS [J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity, 2008, 36 (5): 55-57. [孙凡, 鲁继红, 李垒, 等. 采用固相微萃取-气谱质谱联用技术分析家榆挥发物组成成分[J]. 东北林业大学学报, 2008, 36 (5): 55-57]

Xu GP. Attacting Effect of Host Plants Volatiles ofBemisiatabacionDelphastuscatalinae[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2011. [徐桂萍. 烟粉虱寄主植物挥发物对小黑瓢虫引诱作用的研究[D]. 福建农林大学, 2011]

Xu T, Zhou Q, Xia Q, Zetal. Effects of herbivore-induced rice volatiles on the host selection behavior of brown plant hoppe,Nilaparvatalugerts[J].ChineseScienceBulletin, 2002, 47 (11): 1355-1360.

Yan SC, Xu W, Yuan HE,etal. Effects of differente licitors on olfactory response and oviposition selection ofDendrolimussuperans(Butler) [J].ChineseJournalofAppliedEcology, 2007, 18 (7): 1583-1588. [严善春, 徐伟, 袁红娥, 等. 不同诱导因子对落叶松毛虫嗅觉和产卵选择的影响[J]. 应用生态学报, 2007, 18 (7): 1583-1588]

Yang YZ, Xu D, Cen YJ. Analysis of volatile compounds from young shoots of non-infected and huanglongbing-infected citrus [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2015, 37 (2): 328-333. [杨玉枝, 徐迪, 岑伊静. 健康和感染黄龙病沙糖桔嫩梢挥发性成分的分析[J]. 环境昆虫学报, 2015, 37 (2): 328-333]

Zhao DY, Qin CS, Liao FY,etal. Damages ofPolylophacassiicolaonCinnamomumcamphoraand its chemical control [J].JournalofShanghaiJiaotongUniversity(Agricultural Science), 2016, 34 (4): 36-40. [赵丹阳, 秦长生, 廖仿炎, 等. 樟树上肉桂双瓣卷蛾发生危害及药剂防治[J]. 上海交通大学学报(农业科学版), 2016, 34 (4): 36-40]

Zheng BR. Study on population dynamics and integrated control ofPolylophacassiicolainCinnamomumcassia[J].JournalofFujianForestryScienceandTechnology, 2007, 34 (2): 10-13. [郑宝荣. 肉桂双瓣卷蛾种群动态及综合治理研究[J]. 福建林业科技, 2007, 34 (2): 10-13]

The impact ofPolylophacassiicoladamage on the volatiles ofCinnamomumcamphoraleaves

QIU Hua-Long1, ZHAO Dan-Yang1, MO Xian2, XU Jin-Zhu1, JIE Yu-Ze1, QIN Chang-Sheng1*

(1. Guangdong Academy of Forestry, Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangzhou 510520, China; 2. Forest Disease and Insect Control and Quarantine Station of Zhongshan City, Zhongshan 528400, Guangdong Province, China)

Headspace solid phase micro extraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) technology were used to campare volatiles between normal andPolylophacassiicoladamaged leaves ofCinnamomumcamphora. Results showed that normal andP.cassiicolainjured leaves contained the same 26 volatiles, but relatively content of some volatiles were altered afterP.cassiicoladamage. Specifically, the content of safrole was significantly increased after insect damage. The relative content of safrole was only 0.6% in normal leaves, while it was increased up to 2.7% inP.cassiicoladamaged leaves. Neverrtheless, the relative contents of cis-Sesquisabinene hydrate, cis-nerolidol, anti-nerolidol and α-bisabolene were significantly reduced afterP.cassiicoladamage, they were decreased from 1.9%, 4.5%, 11.6% and 1.2% in normal leaves to 0.6%, 2.1%, 7.0% and 0.7% inP.cassiicoladamaged leaves, respectively. The alteration of content of volatiles might play a key role in regulating the insect feeding and prey searching behavior of natural enemy. This study lay the foundation for exploring the impact of plant volatiles on the behaviour of insect pests and their natural enemy, providing theoretical basis for understanding the three trophic relationships interaction among host plant, insect pest and natural enemy, as well as the use of natural active compounds for the control of insect pests.

Polylophacassiicola; leaf; SPME; GC-MS; volatile

广东省林业科技创新专项(2013KJCX015-4，2015KJCX044)

邱华龙，男，1988年生，助理研究员，从事林业有害生物防治技术研究，E-mail: qiuhualong2008@163.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: 919824595@qq.com

Received: 2016-10-24；接受日期Accepted: 2017-01-12

Q968.1;S433.4

A

1674-0858(2017)02-0464-07

邱华龙，赵丹阳，莫羡,等.肉桂双瓣卷蛾为害对樟树叶片挥发物的影响[J].环境昆虫学报，2017,39(2):464-470.