避免疫苗中有色物质干扰的甲醛残留量测定法

于晓辉，马秋冉，张璐，董玲玲，戴青，杨秀玉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)



避免疫苗中有色物质干扰的甲醛残留量测定法

于晓辉，马秋冉，张璐，董玲玲，戴青，杨秀玉*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

建立了一种能有效避免疫苗中有色物质干扰的甲醛残留量测定法。采用乙酰丙酮分光光度法，利用“本底扣除”的方式，在410 nm波长处对疫苗中甲醛的残留量进行测定。结果显示，酚红、中性红等有色物质均不会对测定结果产生干扰；在0.002～0.2 mg/mL范围内，吸光度与浓度呈良好的线性关系(r=0.9999，n=7)；在0.005、0.05、0.15 mg/mL三种添加浓度下，该方法的平均回收率分别为110.5%、97.5%和101.3%；对24批含有有色物质的疫苗进行测定，所得结果与专属性较强的HPLC法一致。该方法专属性强、准确度好、适用范围宽，可以作为疫苗中甲醛残留量的检测方法。

甲醛；疫苗；有色物质干扰；分光光度法

甲醛溶液作为灭活剂被广泛应用于兽用疫苗的生产中，由于其具有致癌性和致畸性， 因而必须对制剂中游离甲醛的含量进行准确控制，以提高产品的安全性，进而保证动物源性食品的安全性。目前，国内兽用疫苗甲醛残留量测定的法定标准是《中国兽药典》[1]三部，该标准中明确规定“本法仅适用于不含酚红的产品”，即该方法无法准确测定含有酚红的疫苗中甲醛的残留量，主要是因为该方法的测定波长是在可见光区，疫苗中含有的酚红会在测定波长处(410 nm)产生吸收，使得最终的测定结果偏高，造成测定不准确。经查阅得知，现行《中国药典》[2]、《美国药典》[3]、《欧洲药典》[4]和《英国药典》[5]中甲醛残留量的测定波长均在可见光区，且测定方法中均未就如何避免疫苗中有色物质的干扰给出明确的操作建议。

1 材 料

1.1 主要仪器 紫外-可见分光光度计：TU1901，北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平：AE240，瑞士METTLER-TOLEDO公司；恒温水浴锅：DK-S22型，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 主要试剂 甲醛对照品溶液：国药集团化学试剂有限公司(经标定其含量为37.0%)；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。供试疫苗样品的相关信息见表1(供试疫苗均以编号表示)。

表1 供试疫苗样品信息Tab 1 Information of tested vaccines

2 方法与结果

2.1 溶液制备 乙酰丙酮试液：量取乙酰丙酮7.0 mL，加乙醇14 mL，混匀，加水至1000 mL。醋酸-醋酸铵缓冲液：量取醋酸5.2 mL，加水至40 mL；称取醋酸铵173.4 g，加水至1000 mL，使溶解；将上述两种溶液混匀，即得。对照储备液：精密称定甲醛对照品溶液约140 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含甲醛1.0 mg的对照储备液。对照溶液：精密量取对照储备液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。供试溶液：量取被测疫苗样品5.0 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.2 实验方法 步骤1：分别量取对照溶液、供试溶液、水各0.5 mL，置具塞试管中，加醋酸-醋酸铵缓冲液10 mL，乙酰丙酮试液10 mL，置60 ℃水浴15 min，冷水冷却5 min，放置20 min后，以空气为参比，在410 nm的波长处测定吸光度，即得A对照、A供试、A空白-1。步骤2：分别量取供试溶液和水各0.5 mL，置具塞试管中，加醋酸-醋酸铵缓冲液20 mL，置60 ℃水浴15 min，冷水冷却5 min，放置20 min后，以空气为参比，在410 nm的波长处测定吸光度，即得A本底、A空白-2。

2.3 计算方法 根据Lambert-Beer定律和吸光度具有可加和性的特性得知，待测溶液的总吸光度等于溶液中各组分吸光度之和，即：

A供试=样品中甲醛吸光度+样品本底吸光度+乙酰丙酮吸光度+10 mL缓冲液吸光度

(1)

A本底=样品本底吸光度+20 mL缓冲液吸光度

(2)

A对照=对照液中甲醛吸光度+0.5 mL水的吸光度+乙酰丙酮吸光度+10 mL缓冲液吸光度

(3)

A空白-1=0.5 mL水的吸光度+乙酰丙酮吸光度+10 mL缓冲液吸光度

(4)

A空白-2=0.5 mL水的吸光度+20 mL缓冲液吸光度

(5)

将式(1)、式(2)与式(3)、式(4)两两合并同类项加减，得到：

A供试- A本底=样品中甲醛吸光度+乙酰丙酮吸光度-10 mL缓冲液吸光度

(6)

A空白-1- A空白-2=乙酰丙酮吸光度-10 mL缓冲液吸光度

(7)

将式(6)、式(7)合并同类项加减，即得：

2.4 专属性 本研究采用的方法是乙酰丙酮法，即甲醛和显色剂乙酰丙酮在pH值约为6的环境下，迅速生成稳定的黄色化合物。该法选择性强，共存的其他化合物不易参与反应。酚红和中性红作为指示剂，经常用于培养基和细胞维持液的制备中，成为疫苗颜色的主要来源。焦亚硫酸钠作为灭活阻断剂，也会用于疫苗生产过程中。

本研究以酚红、中性红和焦亚硫酸钠为考察对象，验证了这三种化合物均不会参与甲醛与乙酰丙酮的反应，即这些化合物产生的干扰都可以通过“本底扣除”的方式抵消。具体实验过程如下：分别配制0.02%酚红溶液、0.002%酚红溶液、0.1%中性红溶液和0.4%焦亚硫酸钠溶液，按照2.2项中的步骤1和步骤2操作，即得A1和A2，具体结果见表2。

根据表2的结果得知，当反应液中含有乙酰丙酮时(步骤1)，酚红、中性红、焦亚硫酸钠的吸光度值与不含乙酰丙酮时(步骤2)的吸光度值几乎完全一致，表明这三种化合物的吸光度值均为自由颜色吸收，不是与乙酰丙酮反应的结果，即这三种化合物均不会参与甲醛与乙酰丙酮的反应，它们产生的干扰可以通过“本底扣除”的方式抵消。实验结果证明，该方法的专属性良好。

表2 专属性验证结果Tab 2 Results of specificity

2.5 线性、范围及定量限 量取2.1项下的对照储备液适量，用水稀释，制得浓度为0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL的对照溶液，按照2.2项下的方法操作，测定吸光度值，以浓度X对吸光度Y作图(图1)，得到甲醛的线性回归方程为Y=6.7497X-0.0081(r=0.9999，n=7)，线性范围为0.002～0.2 mg/mL。

实验结果表明，当对照溶液浓度大于等于0.3 mg/mL时，吸光度值不稳定，无法准确测定。当对照溶液浓度小于等于0.001 mg/mL时，吸光度值小于A空白-1，所以，本法的定量限为0.002 mg/mL。

图1 甲醛线性关系图Fig 1 Linear relationship of formaldehyde

2.6 回收率 以22号样品为考察对象，向其中添加浓度为0.005、0.05、0.15 mg/mL的甲醛对照溶液，每种浓度平行制备3份样品，按照2.2项下的方法操作，测定吸光度值，按照2.3项下的方法计算，结果见表3。

根据表3的结果得知，在0.005、0.05、0.15 mg/mL三种添加水平下，该方法的回收率在96.95%～116.19%之间，结果令人满意，表明方法的准确度良好。

2.7 精密度和溶液稳定性 量取对照储备液适量，分别配制浓度为0.005 mg/mL和0.02 mg/mL的甲醛对照溶液，每种浓度各配制5份，按照2.2项下的方法操作，测定吸光度值。结果，浓度为0.005 mg/mL时，RSD=1.8%；浓度为0.02 mg/mL时，RSD=0.3%，表明方法的精密度良好。

取上述两种浓度的对照溶液，分别于0、0.5、1.5、3.5 h，按照2.2项下的方法操作，测定吸光度值。结果表明，两种浓度下，吸光度值的RSD分别为0.2%和0.1%。实验表明，溶液在3.5 h内保持稳定。

2.8 方法应用 按照2.2项下的方法，对24批含有有色物质的疫苗进行测定，并将测定结果与已经经过验证的高效液相色谱法[6]进行比较，结果见表4。

从上述测定结果得知，本研究新建立的甲醛残留量测定法的测定结果，与经过验证的高效液相色谱法的测定结果几乎完全一致；新建方法设定了定量限，保证了测定结果更客观。现行《中国兽药典》中甲醛残留量测定法的测定结果均比新建方法高，其中，偏差最大的甚至高达228%，这其中的原因主要是因为疫苗中的有色物质对测定结果产生了干扰，尤其当疫苗中甲醛含量较低时，干扰就更显著。

3 讨论与小结

本研究2.2项下步骤1的操作源自现行版《中国兽药典》三部，而步骤2中的方法则是本研究的创新点，即通过只添加缓冲液、不添加显色剂乙酰丙酮，得到供试疫苗本底吸光度值。为了保证步骤1UV-新：本研究新建立的甲醛残留量测定法；UV-原：《中国兽药典》[1]中甲醛残留量测定法；ND：低于方法的定量限。

表3 回收率测定结果Tab 3 Tesults of recoveries

表4 24批疫苗样品测定结果Tab 4 Results of 24 batches of vaccines

和步骤2中制备的溶液体积一致(即浓度一致)，步骤2中缓冲液的加入量为20 mL。本研究对现行《中国兽药典》中甲醛残留量的测定方法进行了改进，应用新建立的方法对24批含有酚红等多种有色物质的疫苗进行了测定，并将测定结果与专属性较强的高效液相色谱法[6]进行了比较和验证。本研究创新采用了“本底扣除”的检测技术成功解决了疫苗中有色物质干扰测定结果的问题。经文献查阅得知，目前国内外尚未见应用该方法测定疫苗中甲醛残留量的相关报道。相比于HPLC法，“本底扣除”的方法不但结果准确，而且操作简便、成本低廉。

通过上述实验得知，本研究建立的方法专属性强、准确度高，可以作为各类疫苗(含有色物质疫苗和不含有色物质疫苗)中甲醛残留量的测定方法。本研究为扩大现行《中国兽药典》的适用范围提供了有力的技术支持，也为更好的控制兽用疫苗质量提供了可靠的实验依据。

[1] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典.三部[M].北京：中国农业出版社，2010.

Commission of Chinese veterinary pharmacopoeia. Veterinary Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume III[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2010.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

Commission of Chinese pharmacopoeia. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume II[M]. Beijing: China Medical Science Press, 2010.

[3] The United States Pharmacopeial Convention. U.S.P38-NF33 [S].

[4] European Pharmacopoeia Commission. EP 8 [S].

[5] British Pharmacopoeia Commission. BP 2015[S].

[6] 马秋冉，张 璐，戴 青，等. 柱前衍生化-高效液相色谱法检测疫苗中游离甲醛含量[J]. 中国兽药杂志. 2016，50(8)：20-23.

Ma Q R,Zhang L,Dai Q,et.al.Determination of Free Formaldehyde Content in Vaccine by Pre-column Derivatization HPLC[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50(8): 20-23.

(编辑：侯向辉)

Detection of Free Formaldehyde in Vaccines Avoiding Interference from Colored-Substances

YU Xiao-hui，MA Qiu-ran，ZHANG Lu，DONG Ling-ling，DAI Qing，YANG Xiu-yu*

(China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081，China)

YANG Xiu-yu, E-mail: yxyyang0903@163.com

To establish a method for the detection of free formaldehyde in vaccines that can avoid the interference from colored substances, the analysis was performed by acetyl acetone spectrophotometric method with the means of "deducting background" at 410 nm. Phenol red and neutral red did not interfere with the result; the linearity range was 0.002～0.2 mg/mL (r=0.9999，n=7) , and under 0.005, 0.05, 0.15 mg/mL levels of accession, the average recoveries were respectively 108.6%, 97.5% and 101.3%; 24 batches of sample were detected by the new established method, and the results were in agreement with HPLC. The method is characterized by good specificity and accuracy with wide adaptive range. It can be used for the formaldehyde detection in vaccines.

formaldehyde; vaccines; colored-substance interference; spectrophotometry

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.05

于晓辉，硕士，副研究员，从事兽药检测工作。

杨秀玉，E-mail：yxyyang0903@163.com

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 05-0022-06

S859.797