PPARγ1基因转染对缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用和影响

刘永平，魏来，陈文雁，孔高茵

（湖南省人民医院 麻醉医学中心，湖南 长沙 410005）

PPARγ1基因转染对缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用和影响

刘永平，魏来，陈文雁，孔高茵

（湖南省人民医院 麻醉医学中心，湖南 长沙 410005）

目的 探讨心肌细胞过表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ1（PPARγ1）基因对缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的作用和影响。方法30只SD大鼠随机分为SHAM组、MIRI组、PPARγ1组，每组10只。SHAM组和MIRI组经冠状动脉转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（Ad-EGFP），PPARγ1组转染携带PPARγ1基因的腺病毒载体（Ad-PPARγ1）至心肌组织。稳定3 d后，SHAM组只过线，不接扎；MIRI组和PPARγ1组行心肌缺血再灌注损伤（缺血30 min，再灌注120 min）。电镜下观察各组心肌的超微结构变化，Western blot检测B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl2）和Bcl2相关X蛋白（Bax），DNA断裂的原位末端标记法观察心肌细胞凋亡情况。结果缺血再灌注后，电镜下MIRI组心肌细胞结构损伤最严重，心肌纤维排列紊乱，有断裂和溶解现象，线粒体肿胀，结构模糊，部分嵴断裂溶解；PPARγ1组结构损伤较MIRI组减轻。与SHAM组比较，MIRI组Bcl2/Bax比值下降（P<0.05），PPARγ1组无明显变化（P>0.05）；与MIRI组比较，PPARγ1组Bcl2/Bax比值上升（P<0.05）。MIRI组和PPARγ1组的心肌细胞凋亡数目较SHAM组升高（P<0.05）；MIRI组高于PPARγ1组（P<0.05）。结论过表达PPARγ1基因能通过抗氧化应激、减少细胞凋亡来保护缺血再灌注心肌。

心肌缺血再灌注损伤；过氧化物酶体增殖物激活受体γ1；细胞凋亡

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢复血液灌注后，其细胞结构损伤及细胞功能障碍进一步加重的现象。临床上十分常见，如心肺复苏术、冠状动脉溶栓术、冠状动脉支架植入术、体外循环下心内直视手术等，尽早恢复受损心肌的血液灌注是临床上抢救的首要目标，但其带来的再灌注损伤早就引起学者的重视，大量的研究发现，细胞凋亡参与MIRI是MIRI重要的病理生理机制之一。随着对MIRI机制的深入研究，运用基因治疗的方法防治MIRI成为近年来众多学者的研究热点[1-3]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ1（peroxisom eproliferator-activated receptor γ1，PPARγ1）是由配体激活的转录因子，其激活对调节体内的多种病理生理过程有重要作用。有研究认为，匹格列酮（PPARγ配体）通过抗氧化、抑制炎症因子表达等，对缺血再灌注心肌具有保护作用[4-5]。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取健康成年雄性SD大鼠30只，月龄2～3个月，体重200 g～250 g，由湖南斯莱克景达公司提供。大鼠随机分为SHAM组、MIRI组、PPARγ1组，每组10只。SHAM组：转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（Ad-EGFP，上海吉凯基因技术有限公司提供）0.1 ml，滴度1×109PFU/ml，3 d后开胸，冠状动脉左前降支只过线，不结扎；MIRI组：转染Ad-EGFP 3 d后，结扎左前降支30 min，再灌注120 min；PPARγ1组：转染携带PPARγ1的腺病毒载体（PPARγ1，上海吉凯基因技术有限公司提供）0.1 ml，滴度1×109PFU/ml，3 d后结扎左前降支30 min，再灌注120 min。

1.2 复制动物模型

基因转染过程参照文献[6-7]。大鼠麻醉后固定，气管插管控制呼吸，开放尾静脉输液，接生理记录仪记录并分析心电图的变化。左胸部消毒、铺巾后，胸骨左缘3、4肋间进胸，打开心包，暴露心脏，分离主、肺动脉根部并在其下方过1根10号线；将线拉紧阻断主、肺动脉，同时心尖部用27号针头注入0.1 ml各组相应试剂至左心室腔，10 s后将线松开，通过心脏的跳动，使试剂通过冠状动脉循环进行充分的心肌分布，期间密切观察心脏的变化，如心跳无异常及心脏无明显出血后，充分膨肺并关胸。术毕，呼吸稳定后拔管。MIRI模型参照文献[8-9]。采用阻断大鼠冠状动脉左前降支复制MIRI模型。基因转染建立3 d后，用同样的方法麻醉、固定、控制呼吸、监测，原切口开胸，以6-0线于左心耳下缘2 mm处连同心大静脉一起结扎左前降支，结扎线以下心肌组织变紫，心电图呈现ST段弓背抬高为结扎成功的标志，结扎30 min，再灌注120 min。

1.3 指标检测

实验末立即开胸取心，4℃冷生理盐水中漂洗，取部分缺血区心肌组织，浸入2.5%戊二醛中，4℃冰箱保存，为电镜提供材料；取部分缺血区心肌组织，10%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，DNA断裂的原位末端标记法 [terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]测凋亡；余心肌缺血组织按Western blot检测制成组织匀浆，测B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl2）和B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）含量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜结果

2.1.1 SHAM组 心肌纤维排列整齐，肌小节各带清晰，线粒体包膜完整、分布均匀，基质均匀致密、嵴清晰完整。见图1。

2.1.2 MIRI组 心肌明显水肿，心肌纤维排列紊乱，有断裂和溶解现象，明暗带不清，线粒体肿胀，结构模糊，部分嵴断裂溶解。见图2。

2.1.3 PPARγ1组 心肌轻度水肿，肌丝排列尚整齐，明暗带尚清楚，线粒体轻度肿胀，部分嵴断裂溶解。见图3。

2.2 心肌细胞凋亡

正常细胞核为蓝色，凋亡细胞核为棕黄色。采用凋亡指数（凋亡指数=凋亡阳性细胞核数/总细胞核数×100%）来反映和比较各组心肌细胞凋亡整体情况。SHAM组、MIRI组、PPARγ1组大鼠心肌细胞凋亡指数分别为（1.7±0.4）%、（22.5±2.1）%和（14.8±1.6）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=7.331，P=0.003），SHAM组大鼠心肌细胞几乎无凋亡；与SHAM组比较，MIRI组和PPARγ1组大鼠心肌细胞凋亡增多（t=17.359和10.946，P=0.000）；与MIRI组比较，PPARγ1组大鼠心肌细胞凋亡减少（t=6.412，P=0.000）。见图4～6。

图1 SHAM组电镜结果（×8 000）

图2 PPARγ1组电镜结果（×8 000）

图3 MIRI组电镜结果（×8 000）

图4 SHAM组凋亡细胞（×200）

图5 MIRI组凋亡细胞（×200）

图6 PPARγ1组凋亡细胞 （×200）

2.3 各组大鼠心肌Bcl2、Bax蛋白表达水平变化

各组大鼠心肌Bcl2、Bax蛋白变化，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MIRI组Bcl2蛋白表达水平与SHAM组比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（t=1.069，P=0.295）；MIRI组Bax蛋白表达水平、Bcl2/Bax比值与SHAM组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=7.064和4.339，P= 0.000），MIRI组Bax蛋白表达水平上升，Bcl2/Bax比值下降。

PPARγ1组Bcl2、Bax蛋白表达水平与SHAM组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=4.189和3.279，P=0.000和0.003），PPARγ1组Bcl2、Bax蛋白表达水平上升；PPARγ1组 Bcl2/Bax比值与SHAM组比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（t= 0.205，P=0.839）。

PPARγ1组Bcl2、Bax蛋白表达水平及Bcl2/Bax比值与MIRI组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=5.258、3.785和 4.135，P=0.000、0.001和0.000），PPARγ1组Bcl2表达上调，Bax表达下调，Bcl2/Bax比值上升。见附表。

附表 各组Bcl2、Bax蛋白表达变化 （n=10，±s）

附表 各组Bcl2、Bax蛋白表达变化 （n=10，±s）

注：1）与SHAM组比较，P<0.05；2）与MIRI组比较，P<0.05

组别Bcl2/Bax SHAM组 0.58±0.06 0.36±0.03 1.61±0.13 MIRI组 0.50±0.07 0.81±0.061） 0.62±0.091）PPARγ1组 0.89±0.081）2） 0.57±0.051）2） 1.56±0.172）F值 6.713 5.297 4.512 P值 0.004 0.012 0.020 Bcl2Bax

3 讨论

有研究发现，细胞凋亡在MIRI的发展过程中扮演着重要角色，可能是MIRI发病机制中的重要环节之一[10]。细胞凋亡是一种受基因调控的程序性细胞死亡，细胞凋亡的过程非常复杂，Bcl2家族对细胞凋亡的调控具有很重要的作用。Bcl2家族蛋白的主要作用靶点位于线粒体膜上，在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用[11]。Bcl2/Bax比值对调控细胞凋亡具有重要的意义。HOCHHAUSER等[12]研究发现，与野生型小鼠相比，Bax基因敲除的小鼠心肌梗死28 d后发现其左室舒张末期压和收缩末期内径下降，肌酸激酶与乳酸脱氢酶下降，心肌梗死面积变小，其抗凋亡效应起到心肌保护的作用。DAS等[13]研究发现，心肌细胞在缺血的病理生理过程中，其Bcl2/Bax比值决定细胞的生存或死亡。

PPAR是核受体超家族成员，有多种亚型，其中PPARγ是近年来最受关注的亚型，依赖配体激活，其活化后在转录水平调控多种细胞增殖、侵袭、分化和凋亡。PPARγ的配体包括天然配体和合成配体两类：①天然配体有15-脱氧前列腺素J2（15d-PGJ2）等；②而合成配体包括罗格列酮、吡咯列酮、环格列酮和曲格列酮等。PPARγ配体保护心肌的文献报告很多，然而不同化学结构其发挥保护作用的机制并不一样[14-16]。与罗格列酮比较，15d-PGJ2能激活PPARα、PPARγ，上调血红素加氧酶-1的表达，抑制NFκB、细胞间黏附分子-1、P选择素、巨噬细胞趋化蛋白1、诱导型一氧化氮合酶的表达，从而发挥心肌保护作用。LI等[17]研究发现，PPARγ通过抑制促炎介质基因的转录，从而在各种炎症损伤进程及炎症诱导的细胞凋亡中发挥重要的作用。REN等[18]研究发现，双氧水H2O2通过下调心肌细胞Bcl2蛋白而诱导凋亡，罗格列酮通过上调Bcl2而抵抗H2O2的氧化应激；Bcl2沉默后过表达PPARγ，心肌细胞对氧化应激敏感性增强，从而证明PPARγ能够通过上调Bcl2而对抗氧化应激，减少凋亡。

本研究发现，心肌在经历缺血再灌注后，心肌细胞超微结构发生明显改变，表现为心肌水肿明显，心肌纤维排列紊乱，有断裂和溶解现象，明暗带不清，线粒体肿胀，结构模糊，部分嵴断裂溶解；而PPARγ1组损伤明显减轻，表现为心肌轻度水肿，肌纤维排列尚整齐，明暗带尚清楚，线粒体轻度肿胀，部分嵴断裂溶解，说明过表达PPARγ1能明显减轻心肌细胞超微结构的改变。TUNEL法测凋亡显示，MIRI组有大量的心肌细胞凋亡，PPARγ1组则明显减少；而Bcl2/Bax的结果表明，与SHAM组比较，MIRI组降低；PPARγ1组无明显变化；与MIRI组比较，PPARγ1组回升（P<0.05），这表明心肌在发生I/R损伤后，很多心肌细胞发生凋亡，然而过表达PPARγ1能明显减少心肌细胞凋亡的发生，对心肌细胞起到保护作用。众所周知，MIRI机制复杂，冠状动脉转染PPARγ1基因抑制细胞凋亡的机制可能是冠状动脉转染PPARγ1基因后，导致PPARγ1基因在心肌过度表达，激活线粒体Bcl2/Bax通路，通过上调Bcl2/ Bax比值从而实现抑制细胞凋亡的作用。

MIRI是一个复杂的病理生理过程，涉及到氧自由基、钙超载、能量代谢障碍、中性粒细胞、细胞凋亡等因素，迄今尚无很好的防治手段。基因治疗针对的是异常基因本身，是对疾病根源的治疗，给疾病的预防和治疗带来新的希望，具有重要的医学价值，目前在心血管，癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病等领域已是研究热点。本研究发现，过表达PPARγ1基因能通过抑制细胞凋亡，减轻心肌细胞结构的改变而起到心肌保护的作用。基因治疗作为一种全新的治疗手段，随着各种安全、高效、特异、可控的病毒和非病毒载体不断被研发，新的目的基因不断被扩展，基因治疗必将发挥着越来越重要的作用。

[1]B魣譙EZ B,HEUSCH G,OVIZE M,et al.Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Journal of the American College of Cardiology,2015,65(14):1454-1471.

[2]ONG S B,SAMANGOUEI P,KALKHORAN S B,et al.The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury[J].Journal of Molecular Cellular Cardiology,2015,78:23-34.

[3]SIVARAMAN V,YELLON D M.Pharmacologic therapy that simulates conditioning for cardiac ischemic/reperfusion injury[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology Therapeutics,2014,19(1): 83-96.

[4]申琳,王浩,叶平.吡格列酮对大鼠缺血/再灌注心肌过氧化物酶体增殖物受体γ辅激活因子lα表达的影响[J].南方医科大学学报,2014(2):197-200.

[5]赵德福.吡格列酮对大鼠脑缺血再灌注的保护作用[J].辽宁医学院学报,2016,37(3):25-32.

[6]KASPAR B K,ROTH D M,LAI N C,et al.Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus[J].J Gene Med,2005,7(3):316-324.

[7]杨昭云,徐军美,姜金玉,等.人白细胞介素-10和Bcl-2基因重组腺病毒经冠状动脉转染大鼠心肌的可行性[J].中华麻醉学杂志, 2006,26(11):1001-1004.

[8]THIBAULT H,GOMEZ L,DONAL E,et al.Acute myocardial infarction in mice:assessment of transmurality by strain rate imaging[J].Am J Physiol,2007,293(1):H496-H502.

[9]BHINDI R,WITTING P K,MCMAHON A C,et al.Rat models of myocardial infarction pathofenetic insights and clinical relevance[J].Throm Haemost,2006,96(5):602-610.

[10]赵文峰,高建芝,张金盈.心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的信号转导通路[J].新乡医学院学报,2015,32(4):18-22.

[11]QIN F,YAN C,PATEL R,et al.Vitamins C and E attenuate apoptosis,betaadrenergic receptor desensitization,and sarcoplasmic reticular Ca2+ATPase down-regulation after myocardial infarction[J].Free Radic Biol Med,2006,40(10):1827-4293.

[12]HOCHHAUSER E,CHEPORKO Y,YASOVICH N,et al.Bax deficiency reduces infarct size and improves long-term function after myocardial infarction[J].Cell Biochem Biophys,2007,47(1): 11-20.

[13]DAS D K,MAULIK N.Mitochondrial function in cardiomyocytes:target for cardioprotection[J].Curr Opin Anaesthesiol, 2005,18(1):77-82.

[14]高夏青,薛凌.罗格列酮对兔心肌缺血再灌注所伤保护机制的研究[J].中国现代应用药学,2014,31(3):265-270.

[15]ZHANG J,LI X X,BIAN H J,et al.Inhibition of the activity of Rho-kinase reduces cardiomyocyte apoptosis in heartischemia/reperfusion via suppressing JNK mediated AIF translocation[J].Clin Chim Acta,2009,401(1-2):76-80.

[16]王峰,梁贵友,刘达兴,等.罗格列酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠胰岛素抵抗及炎性因子、内皮素-1的影响[J].中国生化药物杂志,2014,34(9):75-77.

[17]LI Y,WU J,YAN C,et al.Correlation of PPARγ and NF-kB expression with arsentic induced hepatic fibrosis in rats[J]. World J Gastroenterol,2010,18(36):3848-3856.

[18]REN Y,SUN C,SUN Y,et al.PPAR gamma protects cardiomyocytes against oxidative stress and apoptosis via Bcl-2 upregulation[J].Vascul Pharmacol,2009,51(2/3):169-174.

（童颖丹 编辑）

Effects ofPPARgamma 1 gene transfection on apoptosis of cardiomyocytes after ischemia reperfusion

Yong-ping Liu,Lai Wei,Wen-yan Chen,Gao-yin Kong
(Department of Anesthesiology,Hunan Provincial People's Hospital, Changsha,Hunan 410005,China)

ObjectiveTo explore the effect and influence of over-expression of peroxisome proliferatoractivated receptor γ1(PPARγ1)gene on the apoptosis of myocardial cells after ischemia reperfusion.MethodsThirty SD rats were randomly divided into three groups(10 in each group),i.e.group A(sham group),group B(myocardial ischemia-reperfusion group)and group C (PPARγ1gene group).Myocardial tissues were transfected with recombinant adenovirus vector mediated enhanced green fluorescent protein (Ad-EGFP)via coronary artery in the groups A and B.Myocardial tissues were transfected with recombinant adenovirus vector mediatedPPARγ1gene(Ad-PPARγ1)in the group C.In the group A the coronary artery was crossed through with a line without ligation;while myocardial ischemia-reperfusion injury(ischemia 30 min,reperfusion 120 min) was induced in the groups B and C three days later.Under electron microscope the changes of the myocardial ultrastructures were observed.Bcl-2 and Bax expressions in the heart were detected by Western blot. TUNEL method was used to measure myocyte apoptosis.ResultsAfter ischemia and reperfusion,the cardiomyocytes in the group B were injuried most seriously under electron microscope;the myocardial fibers were arranged irregularly,ruptured and dissolved;the mitochondria were swellon with fuzzy structure and partialcristae fragmentation and dissolution.The subcellular structure damage in the group C was milder than that of the group B.Compared with the group A,Bcl-2/Bax ratio decreased significantly in the group B (P<0.05),but had no significant change in the group C (P>0.05).Compared with the group B,Bcl-2/Bax ratio in the group C increased significantly (P<0.05).The number of apoptotic cardiomyocytes in the groups B and C was significantly larger than that in the group A (P<0.05).The number of myocardial apoptosis in the group B was significantly larger than that in the group C(P<0.05).ConclusionsOver-expression ofPPARγ1gene can protect myocardial tissues from ischemia reperfusion injury by reducing oxidative stress and cell apoptosis.

myocardial ischemia-reperfusion injury;peroxisome proliferator-activated receptorγ1;cell apoptosis

R542.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.005

1005-8982（2017）09-0025-05

2016-01-28

孔高茵，E-mail：konggaoyin@sina.com