红花槭离体培养及标准化繁殖

郭小芳,吕秀立,余 刚,张 莹

(1德州世纪风园艺科技创新有限公司,德州253500;2上海市园林科学规划研究院,上海200232;

3上海城市困难立地绿化工程技术研究中心,上海200232;4国家林业种质资源平台-上海子平台,上海200232;5陕西省西安植物园,西安710061)

槭树科(Aceraceae)植物约200种,主要分布于北半球温带地区,我国约150种,各地都有分布,主产长江流域及其以南地区。我国自20世纪80年代开始进行槭树属植物的引种繁育研究,在育苗技术上积累了一定的种植经验[1-2]。红花槭变异较大,各个性状及每个性状之间的相对性状变异广泛,多样性非常丰富,但其性状的变异并没有随立地条件不同而发生较大波动,由此认为各个性状的变异是可遗传的[5]。‘夕阳红’(A.rubrum‘Red Sunset’)和‘十月红’(A.rubrum‘October Glory’)是上海市园林科学规划研究院于2004年从北美地区引进的优良品种,经过十几年的观察发现,其在上海地区表现出良好稳定的彩叶效果[3],耐炎热,耐干旱,适应上海气候,符合上海市彩化需要,已用于上海的诸多绿化市政工程中。北京、天津等地园林绿化工程中已用优良苗木上万株,市场需求旺盛[4]。引种到山东以来,两个品种也表现出良好的观赏性和适应性,青岛、淄博等地每年的红花槭种苗产量均在万株以上,但价格较高[6],为了满足市场需求及降低种苗成本,本试验开展了‘夕阳红’和‘十月红’规模化育苗技术研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘夕阳红’(A.rubrum‘Red Sunset’):变色时间较早,一般在12月初开始变色,彩叶期长达20 d,整株色彩丰富,通常橙色、金色、红色共存,且层次分明,绚烂多彩。

‘十月红’(A.rubrum‘October Glory’):变色时间较晚,通常继‘夕阳红’落叶之后在12月底开始变色,彩叶期长达20 d,变色整齐度高,整株全红,颜色红艳亮丽。

‘夕阳红’与‘十月红’二者配置种植,彩叶期可延续50 d左右,丰富冬季景观。从‘夕阳红’与‘十月红’健壮无病虫害植株上取带腋芽茎段作为外植体,进行组织培养。

1.2 灭菌方法

不同季节取样后,去除枝叶,将茎段剪成2 cm长,每节带一个腋芽或顶芽。流水冲洗2 h,于超净工作台上,先用72%的乙醇浸泡30 s,再用不同的灭菌剂浸泡不同时间,最后用无菌水冲洗5—6次,接种于初代培养基中进行初始诱导。筛选最佳灭菌剂、灭菌时间和取样季节。

1.2.1 氯化汞的不同灭菌时间对外植体存活率的影响

设置0.15%(质量体积比,g∕L,下同)氯化汞 6 个不同灭菌时间(4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、15 min),比较不同灭菌时间对外植体成活率的影响,重复3次。存活率=存活数∕接种数×100%。

1.2.2 不同灭菌剂对外植体存活率的影响

用氯化汞和次氯酸钠配制6种灭菌剂,分别为0.10%氯化汞、0.15%氯化汞、0.20%氯化汞、5%次氯酸钠溶液、10%次氯酸钠溶液和15%次氯酸钠溶液。灭菌时间均为8 min,重复3次,存活率计算方法同上。

1.2.3 取材季节对外植体存活率的影响

从1月份至12月份连续取材,进行取材季节对外植体存活率影响的比较。灭菌采用0.15%的氯化汞浸泡8 min,存活率计算方法同上。

1.3 配方设计

借鉴现有报道中筛选出的适宜培养基[7-8],及在此基础上探索出的培养基。初代培养和增殖培养阶段采用MS、1∕2MS和WPM为基础培养基,添加不同种类及不同浓度的激素。

生根阶段采用WPM为基础培养基,NAA、IBA分别设0.1 mg∕L、0.5 mg∕L和1.0 mg∕L 3个梯度。

各种培养基的pH调为5.75,蔗糖3%,琼脂0.64%,分装后在高压灭菌锅中121℃条件下保持18 min。

1.4 培养条件

无菌苗于光照条件下培养,光照强度为1 500 lx,光周期12 h∕d,温度25℃。

1.5 数据统计

每种处理调查20个,重复3次,统计诱导率、芽增殖率、生根率和移栽成活率。采用Excel 2007和SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法进行多重比较(α=0.05)。

诱导率=出芽外植体数∕接种数×100%;增殖率=增殖株数∕接种数;

生根率=生根株数∕接种数×100%;移栽成活率=成活数∕移栽数×100%。

1.6 移栽驯化

生根试管苗洗净培养基后,移栽于草炭和珍珠岩的混合基质中,移栽初期保湿控温。

2 结果与分析

2.1 无菌材料的获得

2.1.1 氯化汞的不同灭菌时间对外植体存活率的影响

使用0.15%的氯化汞灭菌,灭菌时间为4 min时,外植体全部污染;12 min时虽然能获得无菌外植体,但由于灭菌时间过长,存活率较低,仅为5%。存活率最高的灭菌时间是8 min,与其他处理相比,存活率显著提高到15%(表1),因此筛选最佳灭菌时间为8 min。

表1 氯化汞的不同灭菌时间对外植体存活率的影响Table 1 Effects of different sterilization time of mercuric chloride on the survival rate of explants

2.1.2 不同灭菌剂对外植体存活率的影响

灭菌时间为8 min,探索了不同灭菌剂对外植体存活率的影响。当氯化汞浓度为0.1%时,外植体污染严重,没有得到无菌苗;当氯化汞浓度为0.2%时,外植体则全部死亡。与氯化汞处理结果比较,次氯酸钠溶液的灭菌效果显著降低(表2),且用次氯酸钠灭菌后发现外植体褪色至无色,切割时呈软腐状(图1a)。次氯酸钠对红花槭外植体的伤害强于氯化汞,不适宜用于红花槭外植体灭菌。因此,筛选0.15%氯化汞为最佳灭菌剂。

表2 不同灭菌剂对外植体存活率的影响Table 2 Effects of different sterilization agent on the survival rate of explants

2.1.3 不同取材季节对外植体存活率的影响

10月份至次年2月份秋冬季取休眠芽诱导,结果显示:外植体污染率高,存活率仅为0.5%,后期诱导不出无菌苗(表3)。3—5月份取外植体灭菌,与其他月份相比,存活率显著提高,其中4月份取样的存活率最高(20%),茎段两端受消毒液侵害易死亡,但有腋芽的节部良好(图1b),后期能够萌发出无菌苗。因此,确定4月份为最佳取材时间。

表3 不同取材时间对外植体存活率的影响Table 3 Effects of sampling time on the survival rate of explants

2.2 诱导和分化

无菌茎段于培养基(1)、(2)中培养30 d后,顶芽和腋芽都没萌发,后期逐渐形成红色致密的愈伤组织。提高BA、KT浓度,添加低浓度NAA的培养基(3)、(4)依然不能促进顶芽和侧芽的萌发,仅培养基(4)中萌发了1株侧芽。借鉴有关学者筛选出的最佳诱导培养基WPM+6-BA 2.0 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L[7],培养至60 d也没形成丛生芽,茎段完全愈伤化。培养基(6)、(7)中,茎段形成愈伤组织,没有出现无菌苗的萌发。在培养基(8)中,培养90 d后,少量外植体开始萌动,腋芽生长,但叶片容易变黄脱落,生长慢。在添加细胞分裂素2ip的培养基(9)、(10)中,二者诱导率略有提高,无菌苗叶色嫩绿,长势较旺,但基部也易形成大团愈伤组织(图1c)。可见,初代培养以培养基MS+2ip 0.5 mg∕L+GA30.5 mg∕L比较适宜,与其他处理相比,两种红花槭的诱导率显著提高,分别为25%和15%(表4)。

表4 不同激素及不同激素水平对芽诱导的影响Table 4 Effects of different hormone and different hormone concentrations on bud induction

无菌苗长至1 cm高,从外植体上切下,继代于增殖培养基中,培养至20 d,没有分化;培养至40 d,开始出现分化;培养至60 d,试管苗高度为2.5 cm,分化率达到最高。此时培养基干涸不适宜继续培养,需转接入新鲜培养基中,因此培养周期设为60 d,既节约成本,又达到分化最大值。不同基础培养基、激素种类及浓度对增殖率的影响差异显著(表5),WPM培养基较适合增殖培养。在添加细胞分裂素2ip及TDZ的培养基中,试管苗颜色嫩绿长势旺盛,与其他处理相比,培养基WPM+2ip 1.0 mg∕L+TDZ 0.002 mg∕L+GA30.5 mg∕L增殖效果最佳,两个品种分别达到1.35和1.45(图1d)。

表5 不同激素及不同激素水平对芽增殖的影响Table 5 Effects of different hormone and different hormone concentrations on bud multiplication

挑选健壮一致的试管苗,培养于WPM+2ip 1.0 mg∕L+TDZ 0.002 mg∕L+GA30.5 mg∕L培养基中,设置不同的培养温度,培养至60 d时统计培养情况。不同温度对红花槭增殖影响显著,温度为28℃时,增殖率分别为1.95和1.90,显著高于其他处理(表6)。试管苗较整齐,叶色浓绿,平均高度可达3 cm,基部愈伤组织明显减小,有利于后期生根(图1e),这与红花槭本身是喜阳植物有关。

表6 不同温度对芽增殖的影响Table 6 Effects of different temperature on bud multiplication

2.3 生根培养

添加NAA的培养基诱导试管苗生根,速度比较快,但易引起试管苗基部愈伤化,不利于后期移栽;添加IBA的培养基虽然诱导生根时间长,但基部没有愈伤组织。两种生长素单独使用时,培养至30 d,生根率均为50%左右;添加两种生长素的培养基,生根率可达85%以上(表7),根白色细长,可长至2—4 cm,形成完整的试管苗。二者浓度以0.5 mg∕L最合适,既没有愈伤组织形成,也能在最短时间内诱导生根,生根率分别达到85%和90%(图1f),显著高于其他处理。

表7 不同激素及不同激素水平对生根的影响Table 7 Effects of different hormone and different hormone concentrations on rooting

2.4 试管苗移栽

选择根系发达、根长2 cm、生长健壮、无黄叶烂叶的试管苗,温室内先放置3 d以适应光照、温度等外界条件的变化;再开瓶放置3 d以适应干湿度的变化,取出试管苗,洗净根部琼脂,种植于事先备好的基质中。基质采用透气良好的进口草炭,长度4 mm左右,以草炭∶珍珠岩=2.5∶1的比例调成混合基质,于种前2 d浇透,种后浇一遍1 500倍的多菌灵。通过增加小膜风口达到早晚降湿;通过拉遮阳网、将小膜风口适当关小达到中午降温保湿效果,特殊情况下向小膜内壁喷水保湿。缓苗前需补水,补水的量以当天蒸发完为佳;缓苗后干透浇透,并适当延长光照时间来培育健壮种苗。两遍肥水之间加一遍清水,EC值控制在250—500 μS∕cm,肥料按宝力丰∶铵钙镁=7∶3的比例混合。5—7 d施一遍杀菌药,及时防治根蛆。

图1 红花槭离体培养及标准化繁育过程Fig.1 In vitro culture and standardized propagation process of Acer rubrum

移植一个月后,新根发满半个穴盘孔,成活率在90%以上(图1g);继续养护2个月,根部已经形成土球(图1h),高度为10 cm,可作为成品苗发售。2个月以上的生根苗需移植入直径为8 cm的小钵中,以利后期生长(图1i);培养5个月后,高度可达40 cm,可用于林地绿化及上山造林(图1j、1k)。通过以上步骤的精细管理,培育高度为40 cm的红花槭商品苗需要5个月时间,成活率可达80%以上。

3 讨论

目前对美国红枫的组培研究已有多篇报道,红花槭‘白兰地’品种已建立了离体培养体系[7],但后期没有形成规模化生产;以实生苗的叶片和嫩茎段为外植体、以种胚为材料进行研究,也仅诱导出愈伤组织,没有植株再生的报道[8]。本项目筛选表现优良的两个红花槭品种,进行了系统开发研究,克服了高大乔木离体培养时启动困难、培养周期长、易愈伤化等诸多问题,建立了完善的繁殖体系,并进行了规模化生产。目前两个品种已生产出40万株整齐一致的优质种苗,在一定程度上满足了市场需求,对加快两品种的造林绿化具有重要意义,并将对我省乃至整个华北地区工厂化育苗技术的推广和应用起到良好的示范作用,产生巨大的经济效益和社会效益,同时在高大木本植物的繁殖上积累了丰富经验。

[1]尹燕雷,苑兆和,冯立娟,等.国外枫树优良品种引种试验初报[J].山东林业科技,2009(2):18-20.

[2]刘毓,赵遵田,刘媛.国外优良彩叶槭树引种可行性研究[J].山东科学,2010,23(2):47-50.

[3]王铖.2个红花槭品种适生砧木的筛选与培育技术[J].贵州师范大学学报(自然科学版),2011,29(2):4-8.

[4]宗树斌,周春玲,牛立军,等.美国红枫的组织培养研究[J].山东林业科技,2006(1):1-2.

[5]李际红,李玲,范志强,等.北美红花槭实生苗多样性的分析[J].山东农业大学学报(自然科学版),2007,38(2):169-172.

[6]赵之峰,李文清,刘启虎,等.北美鹅掌楸和北美红花槭工厂化大批量育苗技术[J].山东林业科技,2004(2):57-58.

[7]李源,何丙辉,于传,等.美国红枫‘白兰地’的组织培养与快繁技术[J].西南师范大学学报(自然科学版),2014,39(8):36-42.

[8]王振龙,张雷,翟玉敏,等.美国红枫种胚愈伤组织诱导、增殖培养技术研究初报[J].辽宁农业职业技术学院学报,2005,7(4):6-7.