p53、Ki- 67、PCNA的表达与食管鳞癌放疗近期疗效及预后的关系

杨艳，韦淑贞，杜云翔,张闯

(1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠医学院附属解放军82医院 肿瘤中心，江苏 淮安 223001)

·论 著·

p53、Ki- 67、PCNA的表达与食管鳞癌放疗近期疗效及预后的关系

杨艳1,2，韦淑贞2，杜云翔2,张闯2

(1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠医学院附属解放军82医院 肿瘤中心，江苏 淮安 223001)

目的：探讨食管鳞癌组织中p53、Ki- 67及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达与食管癌患者放疗近期疗效及预后的关系。方法：收集接受放疗的食管癌患者83例，采用免疫组化方法检测活检癌组织中p53、Ki- 67及PCNA的表达，并分析其与临床病理特征、放疗疗效和预后的关系。结果：p53、Ki- 67及PCNA在食管鳞癌中高表达率分别为57.8%、72.3%、67.5%。p53、Ki- 67及PCNA表达与性别、年龄、侵犯部位、肿瘤长度等各临床病理因素无关(P>0.05)，p53与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、放疗近期疗效明显相关(P<0.05)，Ki- 67与肿瘤分化程度、淋巴结转移、放疗近期疗效明显相关(P<0.05)，PCNA与临床分期、淋巴结转移、放疗近期疗效明显相关(P<0.05)。p53低、高表达组食管癌患者3年总生存率分别为57.14%、27.08%。结论：p53、Ki- 67及PCNA可作为评价食管癌恶性程度、放射敏感性的生物学指标，p53可作为评价食管癌预后的有效指标。

食管癌; p53； Ki- 67； 增殖细胞核抗原； 放疗敏感性

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国食管癌的发病率和死亡率均居全球首位。由于早期症状不明显，近50%的食管癌患者在确诊时已属中晚期，这部分患者失去了根治性手术治疗机会[1]。此时，放疗就成为治疗食管癌的主要手段之一，放疗敏感性能够直接影响肿瘤治疗效果，目前有许多肿瘤生物标志物，如XRCC4、c- erbB- 2等与放疗敏感性有关。p53、Ki- 67、增殖细胞核抗原(PCNA)等指标在多种肿瘤组织和细胞中过表达，且与肿瘤的发生、发展等密切相关，但其对食管癌放疗敏感性和预后的预测作用尚无定论。本项研究通过免疫组化方法检测食管癌患者组织中p53、Ki- 67及PCNA蛋白的表达，分析其与放疗敏感性、预后的关系，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月至2013年5月间蚌埠医学院附属解放军82医院放疗科首次治疗的食管癌患者83例，KPS评分均≥80，治疗前行胃镜活检，病理类型均为食管鳞状细胞癌。其中男47例，女36例，年龄49～91岁，平均67岁。部位：颈部及胸上段30例，胸中段40例，胸下段13例。食管癌造影显示病变长度>5 cm者17例，≤5 cm者66例。分化程度：高分化鳞癌28例，中分化鳞癌34例，低分化鳞癌21例。食管癌按照2009年中国非手术治疗食管癌临床分期草案标准[2]及陈建州等[3]建议进行临床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期35例，Ⅲ期18例。淋巴结转移情况：一般标准为淋巴结短径≥10 mm,食管旁、气管食管沟、心包角淋巴结长径≥5 mm，腹腔淋巴结长径≥5 mm为淋巴结转移阳性。本研究中发生淋巴结转移者45例，未发生淋巴结转移者38例。

1.2 放疗方法

患者采用6 MV- X射线三维适形放疗或调强放疗，其中大体肿瘤区(gross tumor volume， GTV)包括食管原发灶区，阳性淋巴结(GTVnd)包括阳性的淋巴结；临床靶区(clinical target volume， CTV)包括GTV和GTVnd,在其前后左右外放0.8～1.0 cm，GTV上下外放2～3 cm或GTVnd上下外放1.0～1.5 cm；计划靶区(planning target volume， PTV)在CTV基础上各外放0.5～1.0 cm。高龄及体质弱的患者适当缩小靶区。95%PTV和(或)95%PTVnd处方剂量为60～66 Gy，2 Gy·次-1，1 次·d-1，每周5 d。脊髓最大剂量≤45 Gy，肺平均剂量≤13 Gy，心脏平均剂量≤30 Gy。

1.3 免疫组化染色及结果判定

每个病例的组织蜡块标本制成5 μm厚度的切片，采用ElivisionTMplus法进行免疫组化染色，严格按照试剂盒说明操作。p53、Ki- 67、PCNA 均定义在细胞核内，出现棕色颗粒为阳性细胞，蓝色为阴性细胞。随机观察10个高倍视野，阳性细胞占计数细胞的百分比即为阳性表达率。对p53、Ki- 67、PCNA 结果判断标准：无表达(-)为切片中无阳性细胞；低度表达(+)为阳性细胞数<25%;中度表达(++)为25%≤阳性细胞数<50%；高度表达(+++)为阳性细胞数≥50%。为便于分析，本实验以(-)(+)作为低表达，(++)(+++)作为高表达。

1.4 近期疗效评价

患者放疗后1～3个月进行影像学检查(包括CT、食管造影等)，根据钡餐造影及CT检查结果[4]分为完全缓解 (complete remission，CR) :肿瘤病变完全消失,造影显示边缘光滑，钡剂可顺畅通过，管腔无狭窄，X线可见黏膜基本恢复正常，CT显示最大管壁厚度≤1.2 cm,且放疗后残存淋巴结体积≤1.00 cm3; 部分缓解(partial remission，PR) :肿瘤部分消失，钡剂通过比较清晰，边缘欠光滑，管腔狭窄,CT显示最大管壁厚度≥1.2 cm,且放疗后残存淋巴结体积>1.00 cm3; 无效(no response，NR) :肿瘤未消失，有显著充盈缺损、龛影、狭窄,CT显示有新发病灶。

1.5 随访

所有患者主要以住院或门诊并配合电话方式随访，了解患者生存情况等信息。

1.6 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析,p53、Ki- 67及PCNA的表达与临床病理参数统计方法采用χ2检验，与放疗疗效关系采用Spearman等级相关分析；采用Kaplan- Meier法进行生存分析，并采用log- rank检验比较两组生存率，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料统计结果

83例患者中58例放疗完全结束后继续接受化疗，25例未作任何治疗。近期疗效评价完全缓解 31例， 部分缓解37例，总有效率81.9%(68/83)。患者随访截止日期为2016年6月，中位随访时间26个月,随访率100%

2.2 p53、Ki- 67、PCNA在食管癌组织的高表达率

83例食管鳞癌组织中p53、Ki- 67、PCNA高表达率分别为57.8%(48/83)、72.3%(60/83)、67.5%(56/83),见图1～6。

图1 p53在食管癌细胞中低表达 ×100

Fig 1 p53 was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

图2 p53在食管癌细胞中高表达 ×100

Fig 2 p53 was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

图3 Ki- 67在食管癌细胞中低表达 ×100

Fig 3 Ki- 67 was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

图4 Ki- 67在食管癌细胞中高表达 ×100

Fig 4 Ki- 67 was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

图5 PCNA在食管癌细胞中低表达 ×100

Fig 5 PCNA was weakly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

图6 PCNA在食管癌细胞中高表达 ×100

Fig 6 PCNA was highly expressed in esophageal carcinoma cell ×100

2.3 p53、Ki- 67、PCNA表达与食管癌患者临床病理参数之间的关系

p53、Ki- 67、PCNA的表达水平与食管癌患者性别、年龄、侵犯部位、肿瘤长度等各临床病理因素无关(P>0.05)，而三者在淋巴结转移组中的高表达率均高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。p53与Ki- 67在低分化组患者的高表达率高于中、高分化组患者(P<0.05)，p53与PCNA在食管癌Ⅲ期患者中的高表达率高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。见表 1。

表1 p53、Ki- 67、PCNA与食管癌患者临床病理参数的关系 例

Tab 1 Correlation of p53,Ki- 67,PCNA expression and the clinical characteristics of 83 esophageal patients cases

注：括号中为所占百分比

2.4 p53、Ki- 67、PCNA表达与放疗后近期疗效的相关性

采用Spearman等级分析方法对p53、Ki- 67、PCNA和食管癌近期疗效的相关性进行分析，结果显示:p53、Ki- 67、PCNA的表达高低与放疗近期疗效相关(r=0.271、- 0.229、- 0.246,P<0.05)。p53低表达组中CR率(48.6%)高于高表达组(29.1%)，Ki- 67高表达组CR率(41.7%)高于低表达组(26.1%)，PCNA高表达组CR率(42.9%)高于高表达组(25.9%)，差异均有统计学意义。见表2。

表2 p53、Ki- 67、PCNA表达与放疗后近期疗效的相关性 例

Tab 2 Correlation of p53，Ki- 67，PCNA expression and radiotherapy effect cases

2.5 p53、Ki- 67、PCNA与食管癌患者生存时间的关系

83例食管癌患者3年总生存率为39.8%。用Kaplan- Meier进行生存分析显示p53低表达组食管癌患者3年总生存率57.14%，高表达组3年总生存率27.08%，两者比较差异显著(log- rank检验,P<0．05)。Ki- 67、PCNA蛋白高表达组和低表达组对食管癌患者3年总生存率无显著差异(log- rank检验，P>0．05)。见图7～9。

3 讨 论

随着分子生物学的发展，肿瘤基因的表达检测与预测临床疗效及预后的关系成为近年来研究的热点。

p53作为肿瘤抑制基因，在细胞周期调控、DNA合成抑制、受损DNA修复和细胞凋亡中起关键作用。有研究[5]表明，肿瘤组织中p53 蛋白过表达大多数情况下意味着 p53 基因突变失活为癌基因。本研究显示 p53蛋白高表达率为57.8%,其在低分化、临床分期的Ⅲ期、伴淋巴结转移的食管癌中阳性表达率较高，充分说明 p53 高表达预示着肿瘤的侵袭力、转移能力较强，临床病理分期较晚，预后较差，与雷蕾等[6- 8]的报道一致。细胞周期的变化会影响肿瘤细胞凋亡和对辐射的敏感性，肿瘤细胞对射线最敏感的期限是G1/S期交界点，而进入S期后放疗敏感性就会下降，S晚期敏感性最低。p53基因负向调控细胞分裂和增殖的作用，主要是将肿瘤细胞阻滞在G1/G0期，如果发生突变，因不能阻止细胞由G1期向S期过渡而导致细胞多数进入S期，放疗敏感性下降。余辉等[5]指出，p53基因突变可降低对辐射的敏感性，p53蛋白阳性者对放疗的敏感性低。本研究结果显示p53表达和食管癌放疗近期疗效之间有一定相关性，p53高表达组食管癌患者放疗近期疗效差；Kaplan- Meier法生存分析发现p53低表达组食管癌患者3年总生存率为57.14%、p53高表达组为27.08%，两组差异有统计学意义。因此 p53表达不仅适合作为判断食管癌发生、发展、侵袭力、转移力的生物学指标，而且可作为放疗敏感性及预后预测的新指标。

图7 p53不同表达组食管癌患者的生存分析

Fig 7 Survival analysis of different p53 expression in esophageal patients

图8 Ki- 67不同表达组食管癌患者的生存分析

Fig 8 Survival analysis of different Ki- 67 expression in esophageal patients

图9 PCNA不同表达组食管癌患者生存分析

Fig 9 Survival analysis of different PCNA expression in esophageal patients

Ki- 67 作为一个敏感的细胞增殖标志物，在所有处于细胞增殖周期的细胞核中表达，但在细胞静止期G0期不表达。有研究表明，Ki- 67表达高低与肿瘤的分化程度、转移及预后密切相关[9]。本研究中 Ki- 67在83例食管癌患者中高表达率为72.3%，食管癌低分化者中Ki- 67的高表达率明显高于高、中分化者，有淋巴结转移的食管癌患者 Ki- 67 的表达明显高于无淋巴结转移的患者。有研究[10]表明,Ki- 67高表达的食管癌患者放疗疗效越好，这可能与放射线对增殖期细胞杀伤力较大有关，本研究结果与此一致，高表达组放疗有效率(88.3%)高于低表达组(65.2%)。生存分析Ki- 67 高、低表达组患者3年生存率未显示出显著差异。提示Ki- 67高表达的食管鳞状细胞癌中肿瘤细胞增殖活性高，有较强的侵袭力和恶性程度，同时放射线对其有较高敏感性，但影响食管癌生存的因素较多，Ki- 67还不能用于预后判断。

PCNA为 DNA 聚合酶 δ 的辅助蛋白，参与细胞增殖过程中 DNA 的复制，反映细胞的增殖活性，可作为判断细胞增殖状态的一项指标。在肿瘤及许多增生性病变中 PCNA 的表达显著增加，本研究显示食管癌组织中PCNA高表达率67.5%，且与食管癌患者的淋巴结转移、临床分期有关。Okuno等[11]对 65 例食管鳞癌单纯放射治疗患者的放射治疗前活检标本进行PCNA 和 Ki- 67 指数的检测发现, 两指数与放射治疗患者的局部控制率呈正相关。有研究员[12]对食管癌病人术前的活检标本进行 PCNA 和血管内皮细胞生长因子(EGFR)检测发现，PCNA 和 EGFR 同时阴性的患者对放疗和化疗几乎无反应。张丽珍等[13]研究结果显示，高 PCNA 指数组较低 PCNA 指数组的治疗有效率、局部控制率和生存率均高(P<0.05)。本研究结果显示PCNA蛋白的表达与放疗近期疗效相关，高表达组近期有效率(89.3%)高于低表达组(66.7%)，差异有统计学意义，与前述其他研究结果基本一致。但是生存分析结果显示,PCNA高表达组与低表达组患者生存率比较无显著差异。考虑本研究为回顾性分析，Ki- 67和PCNA未显示出生存差异可能同随访时间短有关。

总之，作为生物标志物，p53、Ki- 67和PCNA对预测食管鳞癌的恶性程度和放疗敏感性是有利的，3个协同检测可能优于单个指标的预测。此外，p53还在评估食管癌患者预后方面显示出巨大的优势，可作为判断食管癌预后的生物学指标之一。

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(本文编辑：周兰波)

Expression of p53，Ki- 67 and PCNA in esophageal squamous cell carcinoma and correlation with radiotherapy effect and prognosis

YANG Yan1,2,WEI Shu- zhen2,DU Yun- xiang2,ZHANG Chuang2

(1.BengbuMedicalcollege,Bengbu233000,China;2.DeprtmentofOncoloy,No.82HospitalofPeople’sLiberationArmySubsidiary,BengbuMedicalcollege,Huai’an223001,China)

Objective:To explore the expression of p53， Ki- 67 and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in esophageal squamous cell carcinoma and its relation with radiotherapy effect and prognosis. Methods: Eighty- three esophageal carcinoma patients who underwent esophageal radiotherapy in our hosiptal were analyzed. Expressions of p53,Ki- 67and PCNA were detected by immunohistochemistry, and its relation with clinicopathologic features, radiotherapy effect and survival rate of esophageal carcinoma patients was analyzed. Results: The positive expression rates of p53,Ki- 67and PCNA were 57.8%,72.3%and 67.5%, respectively. The expressions of p53,Ki- 67and PCNA in different gender，age，tumor position and size had no statistical differences(P>0.05).p53 was related to the tumor differentiation degree, clinical stage,lymph node metastasis and radiotherapy effect(P<0.05).Ki- 67 was related to the tumor differentiation degree,lymph node metastasis and radiotherapy effect (P<0.05). PCNA was related to the clinical stage,lymph node metastasis and radiotherapy effect (P<0.05).Three years overall survival rates of patients in low and high p53 expression groups were 57.14% and 27.08%,respectively. Conclusion: p53， Ki- 67 and PCNA can be used as the predictive markers for judguing malignant degree and radiosensitivity of esophageal carcinoma.p53 will be a useful marker for evaluating the prognosis of esophageal carcinoma.

esophageal carcinoma; p53; Ki- 67; proliferating cell nuclear antigen; radiosensitivity

2016- 09- 05

2016- 12- 10

南京军区医学科技创新重点课题(12Z09)

杨艳(1990-)，女，安徽阜阳人，在读硕士研究生。E- mail:yangyan1521212@163.com

韦淑贞 E- mail:weiwei8222@163.com

杨艳,韦淑贞,杜云翔,等.p53、Ki- 67、PCNA的表达与食管鳞癌放疗近期疗效及预后的关系[J].东南大学学报:医学版,2017,36(2):155- 161.

R735.1; R815

A

1671- 6264(2017)02- 0155- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.005